Erin Chambers和Kenneth J. Fountain
沃特世公司（美國(guó)馬薩諸塞州米爾福德市）
應(yīng)用優(yōu)勢(shì)
沃特世解決方案
關(guān)鍵詞
合相色譜，Oasis，樣品制備，生物分析，三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥，定量，UPC2
簡(jiǎn)介
三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥(TCA)是較老的一類(lèi)藥物，但仍具有藥理學(xué)作用。例如，對(duì)其它類(lèi)抗抑郁藥反應(yīng)較差的藥物受試者仍較常見(jiàn)，由此決定了TCA仍具有持續(xù)的生存空間。此外，這類(lèi)藥物比其它新型的抗抑郁藥要便宜得多，因此在門(mén)診中也有使用。過(guò)去，人們使用GC、 UV、 或LC/MS對(duì)TCA進(jìn)行分析。UPC2™技術(shù)可對(duì)有機(jī)提取物進(jìn)行分析，因此在生物分析測(cè)定領(lǐng)域備受青睞。有機(jī)提取物可通過(guò)此領(lǐng)域中最常見(jiàn)的樣品制備方法，例如蛋白質(zhì)沉淀(PPT)、液-液萃取(LLE)和固相萃取(SPE)法獲得。反相色譜系統(tǒng)在進(jìn)樣前需對(duì)有機(jī)提取物進(jìn)行蒸發(fā)和復(fù)溶，而非水溶劑系統(tǒng)則不需要此環(huán)節(jié)。UPC2技術(shù)具有主要溶劑(CO2)環(huán)保、可再生、可與反相色譜進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)、以及可利用多種固定相的特點(diǎn)，使其具備了低溶劑消耗和低成本的優(yōu)勢(shì)，從而增加了生物分析方法開(kāi)發(fā)的選擇性和靈活性。因此，本實(shí)驗(yàn)以人體尿液中TCA的分析為例，進(jìn)行了一項(xiàng)確證UPC2分離適用性的論證性研究。研究中所用特定TCA的結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。雖然人們對(duì)GC和LC方法開(kāi)發(fā)途徑有很好的定義并在常規(guī)應(yīng)用中使用，但UPC2分離的方法開(kāi)發(fā)仍是一塊較新的研究領(lǐng)域。本應(yīng)用紀(jì)要中重點(diǎn)描述了某些關(guān)鍵的UPC2參數(shù)并提供了適用的篩選選項(xiàng)。例如，色譜柱化學(xué)性質(zhì)、pH和進(jìn)樣溶劑由色譜柱管理器和四元溶劑切換系統(tǒng)進(jìn)行系統(tǒng)化的自動(dòng)篩選。在選擇色譜柱、流動(dòng)相和進(jìn)樣溶劑后，系統(tǒng)將使用通過(guò)篩選試驗(yàn)獲得的最佳條件對(duì)梯度進(jìn)行優(yōu)化并分析尿樣提取物。在尿液檢測(cè)中，各抗抑郁藥的定量下限(LLOQ)0.1 ng/mL可輕松達(dá)到，符合FDA針對(duì)生物分析方法制定的LLOQ測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。另外，簡(jiǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)曲線（無(wú)內(nèi)標(biāo)物）在+/-1%至8%范圍內(nèi)的線性和準(zhǔn)確度良好。
實(shí)驗(yàn)
UPC2條件
系統(tǒng)： ACQUITY UPC2
色譜柱： ACQUITY UPC2 BEH
2.1×50 mm，1.7 µm
流動(dòng)相A： CO2
流動(dòng)相B： 含0.2% NH4OH的甲醇
清洗溶劑： 60:40的乙腈/ 異丙醇+2%甲酸
分離模式： 流動(dòng)相B在2 min內(nèi)從2.0%增加至40%；達(dá)到30%時(shí)保持1 min。
流速： 1.4 mL/min
CCM反壓： 1750 psi
柱溫： 40 ℃
樣品溫度： 10 ℃
進(jìn)樣體積： 2.0 µL
運(yùn)行時(shí)間： 3.0 min
補(bǔ)液流速： 0.25 mL/min含0.2% NH4OH的異丙醇
收集板： 沃特世（Waters®） 1 mL ACQUITY®收集板
MS條件
質(zhì)譜儀： Xevo TQ-S
電離模式： ESI+
毛細(xì)管電壓： 1.0 kV
碰撞能量： 按組分優(yōu)化（見(jiàn)表格1）
錐孔電壓： 按組分優(yōu)化 （見(jiàn)表格1）
數(shù)據(jù)管理
色譜軟件：MassLynx®
定量軟件：TargetLynx™
優(yōu)化軟件：IntelliStart™
圖1. 三環(huán)類(lèi)抗抑郁藥分析物的結(jié)構(gòu)式。
實(shí)驗(yàn)
樣品描述
采用Oasis WCX 96孔 µElution板制備尿樣。首先，在200 µL樣品中加入200 µL的4% H3PO4溶液，混勻；先用200 µL甲醇平衡萃取板中的各孔，然后用200 µL水平衡；將樣品稀釋液(400 µL)加載到板上；依次用200 µL 10 mM醋酸銨溶液(pH 6)、200 µL甲醇淋洗；用含2%甲酸的ACN/MeOH(60:40)溶液洗脫TCA，每次25 µL，洗脫2次，合并洗脫液。取洗脫液2 µL直接注入ACQUITY UPC2系統(tǒng)。
儲(chǔ)備溶液和工作溶液均以甲醇為溶劑。向2 mL尿液中加入20 µL復(fù)合工作溶液（各化合物濃度為1 µg/mL）制成含5種抗抑郁藥的尿樣，此方法制成的尿樣濃度為10 ng/mL。其它濃度的樣品溶液通過(guò)使用對(duì)照人體尿液連續(xù)稀釋高濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液制備而得。在本論證性研究中，制備并用于萃取的尿樣最終濃度分別為：0.1、0.2、0.5、1.0、5.0和10.0 ng/mL。為確定定量下限(LLOQ)，實(shí)驗(yàn)還對(duì)空白尿進(jìn)行了萃取。
|
分析物 |
母離子m/z |
子離子m/z |
錐孔電壓(V) |
碰撞能量(eV) |
|
阿米替林 |
278.3 |
233.1 |
30 |
18 |
|
去甲替林 |
264.3 |
233.4 |
28 |
15 |
|
丙咪嗪 |
281.3 |
85.8 |
25 |
20 |
|
地昔帕明-D3 |
267.4 |
208.1 |
22 |
25 |
表1. 4種抗抑郁藥物組的MS條件。
結(jié)果與討論
之前已證明混合模式SPE是生物分析中最常選擇的一類(lèi)樣品制備方法，這依賴(lài)于其分離分析物與內(nèi)源性干擾物的雙正交保留機(jī)制。因此，混合模式SPE是本次實(shí)驗(yàn)的首選。選用混合模式的弱陽(yáng)離子交換劑基于以下兩個(gè)方面的原因：分析物呈堿性，需要通過(guò)離子交換保留；此特定吸附劑的最終洗脫液實(shí)際呈酸性。進(jìn)樣溶劑的篩選結(jié)果表明，采用酸性進(jìn)樣溶劑可獲得最佳的峰型和靈敏度（此處不作數(shù)據(jù)說(shuō)明）。因此，Oasis WCX是不二之選。對(duì)通用的提取方法稍作修改，確保所有分析物通過(guò)離子交換可完全保留。人體尿液經(jīng)SPE處理后，最終洗脫液中所有分析物的回收率為92%至104%，RSD為3%至6%。SPE洗脫液可直接進(jìn)樣，不需做進(jìn)一步的稀釋或蒸發(fā)，從而簡(jiǎn)化了整個(gè)工作流程，提高了分析通量。
系統(tǒng)性色譜篩選
方法開(kāi)發(fā)過(guò)程對(duì)色譜柱、改性劑和改性添加劑進(jìn)行了系統(tǒng)篩選，以獲得最佳分離結(jié)果。經(jīng)篩選的4種UPC2色譜柱如下：ACQUITY UPC2 BEH、BEH 2-EP、HSS C18 SB和 CSH™ Fluoro-Phenyl，所有色譜柱規(guī)格均為2.1×50 mm，填料粒徑為1.7 µm。3種流動(dòng)相B溶劑分別為甲醇、含0.2%甲酸的甲醇和含0.2% NH4OH的甲醇。篩選過(guò)程采用流動(dòng)相B在3 min內(nèi)從2%增加至45%，達(dá)到45%時(shí)保持1.5 min的常用梯度。當(dāng)以添加有氫氧化銨的甲醇作流動(dòng)相時(shí)，各色譜柱分析所得的峰形、靈敏度和分離度均為最佳。四種固定相使用此高pH流動(dòng)相所得分析結(jié)果的對(duì)比情況如圖2所示。除HSS SB色譜柱外，其它色譜柱的出峰順序相似。但是，由HSS SB色譜柱得出的譜峰明顯更寬，這將導(dǎo)致信噪比降低并影響低濃度樣品的檢測(cè)。峰變寬可能是由于分析物與固定相之間的次級(jí)相互作用所致。采用ACQUITY UPC2系統(tǒng)分析其它類(lèi)化合物（本文未涉及此部分實(shí)驗(yàn)內(nèi)容）時(shí)發(fā)現(xiàn)：使用具有緩沖作用的流動(dòng)相改性劑（如，20至40 mM的甲酸銨）可以改善峰形。在本文的研究中，色譜分析的主要目標(biāo)不是使分析物達(dá)到絕對(duì)的基線分離，而是獲得最佳的峰形和最高靈敏度，因此我們對(duì)各色譜柱所得的峰面積進(jìn)行了測(cè)定。在高pH改性劑條件下，使用各色譜柱得出的分析物峰面積如表2所示。
圖2：以含0.2% NH4OH的甲醇為流動(dòng)相B時(shí)，不同固定相的分析結(jié)果。
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BEH色譜柱 |
BEH 2-EP色譜柱 |
HSS C 18 SB色譜柱 |
CSH FP色譜柱 | |
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阿米替林 |
1066581 |
940444 |
968946 |
940657 |
|
丙咪嗪 |
1291389 |
1180698 |
1690693 |
1145127 |
|
去甲替林 |
1586550 |
963422 |
1256074 |
1143857 |
|
地昔帕明 |
245922 |
149734 |
219268 |
208580 |
表2. 使用4種不同色譜柱所得的峰面積概覽表。
在不同色譜柱的篩選實(shí)驗(yàn)中，阿米替林和丙咪嗪的峰面積無(wú)顯著變化，但地昔帕明和去甲替林受固定相化學(xué)性質(zhì)的影響，峰面積發(fā)生了明顯改變。例如，地昔帕明在使用BEH色譜柱分析時(shí)所得峰面積較其它色譜柱增大了11%至40%。同樣，去甲替林的峰面積在BEH色譜柱分析條件下較其它色譜柱增大了21%至40%。雖然BEH 2-EP色譜柱的總體分離效果較其它色譜柱稍有改善，但采用BEH色譜柱時(shí)信號(hào)強(qiáng)度更高。因此BEH色譜柱是進(jìn)行TCA低濃度水平定量分析的最佳選擇。此外，BEH色譜柱所得色譜峰的平均基線峰寬＜2 s，提高了低濃度樣品測(cè)定的信噪比。
運(yùn)用各個(gè)色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)觀測(cè)到系統(tǒng)最大壓力低于4200 psi，系統(tǒng)在此低于壓力限值的條件下運(yùn)行良好，可以靈活地根據(jù)需要提高流速，進(jìn)一步縮短運(yùn)行時(shí)間。
除對(duì)固定相進(jìn)行了篩選外，本實(shí)驗(yàn)還對(duì)不同的改性劑進(jìn)行了評(píng)估。圖3所示為不同流動(dòng)相B改性劑對(duì)ACQUITY UPC2 BEH色譜柱的影響，其它色譜柱受影響的趨勢(shì)與此相似。使用NH4OH作為改性劑時(shí)常可獲得最佳的分離度和峰形。單獨(dú)用甲醇作流動(dòng)相時(shí)，所得譜峰最寬，洗脫時(shí)間最遲，分離度最差。選擇甲酸作為改性劑時(shí)，所得分析結(jié)果比使用NH4OH所得結(jié)果的保留時(shí)間增大，分離度降低且譜峰更寬。
為縮短運(yùn)行時(shí)間并提高樣品分析通量，本實(shí)驗(yàn)對(duì)篩選梯度進(jìn)行了“壓縮”。結(jié)果表明，梯度壓縮后所得峰形、分離度和靈敏度均未受負(fù)面影響。最終的整個(gè)運(yùn)行時(shí)間確定為3 min。
圖3：使用BEH色譜柱時(shí)，流動(dòng)相B中加入不同改性劑后所得分析結(jié)果。
靈敏度、線性和定量準(zhǔn)確度
本實(shí)驗(yàn)還通過(guò)少量的研究對(duì)方法的準(zhǔn)確度和線性進(jìn)行了評(píng)估。使用濃度范圍為0.1-10.0 ng/mL的對(duì)照人體尿液制備簡(jiǎn)化標(biāo)準(zhǔn)曲線（無(wú)內(nèi)標(biāo)物）。采用“實(shí)驗(yàn)”部分最后確定的分析條件進(jìn)行測(cè)定，按照1/x的加權(quán)系數(shù)計(jì)算所得的曲線呈線性，R2＞0.998，各標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)理論濃度的平均偏差<8%。表3所示為阿米替林的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。對(duì)于所有分析物，0.1 ng/mL的LLOQ均可輕松實(shí)現(xiàn)。此濃度下，阿米替林、丙咪嗪、去甲替林和地昔帕明-D3的信噪比依次為334:1、292:1、590:1和66:1。各組分的信號(hào)強(qiáng)度是空白尿樣提取物信號(hào)的5倍，符合FDA的LLOQ測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。圖4所示為0.1 ng/mL地昔帕明-D3和空白尿液的典型提取離子色譜圖。
圖4. 空白尿液提取物(下方色譜圖)和含0.1 ng/mL地昔帕明-D3的尿液提取物(上方色譜圖)。
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標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(ng/mL) |
保留時(shí)間 |
峰面積 |
與理論值之間的偏差% |
準(zhǔn)確度% |
|
0.1 |
1.48 |
16161 |
-3.3 |
96.7 |
|
0.2 |
1.48 |
27061 |
2.7 |
102.7 |
|
0.5 |
1.48 |
60531 |
7.9 |
107.9 |
|
1.0 |
1.48 |
103149 |
-3.6 |
96.4 |
|
5.0 |
1.48 |
467997 |
-7.9 |
92.1 |
|
10.0 |
1.48 |
999886 |
-0.9 |
99.1 |
表3. 阿米替林(從人體尿液中提取)的典型標(biāo)準(zhǔn)曲線統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。
結(jié)論
UPC2技術(shù)成功應(yīng)用于人體尿液中TCA的分析和定量。主要參數(shù)的自動(dòng)篩選功能為本研究組中的4種TCA提供了極好的分離度和譜峰強(qiáng)度。對(duì)篩選出的梯度條件略作調(diào)整后，最終的總運(yùn)行時(shí)間為3 min，尿液樣品由Oasis WCX 96孔µElution板進(jìn)行提取處理。人體尿液中提取TCA的回收率范圍為92%至104%。簡(jiǎn)化標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液的濃度范圍為0.1-10.0 ng/mL，曲線上各點(diǎn)呈線性分布，平均準(zhǔn)確度為99%。各分析物的LLOQ均可達(dá)到0.1ng/mL，足以滿(mǎn)足生物分析的要求。
總的來(lái)說(shuō)，本應(yīng)用紀(jì)要展現(xiàn)了UPC2這種新型分離技術(shù)在生物分析這一重要應(yīng)用領(lǐng)域中的實(shí)用性和應(yīng)用優(yōu)勢(shì)。UPC2技術(shù)使用綠色環(huán)保的CO2作為主要流動(dòng)相、樣品無(wú)需稀釋或濃縮即可直接進(jìn)樣，另具公認(rèn)的正交性（對(duì)反相色譜而言），使其在生物基質(zhì)中藥物的分析定量方面?zhèn)涫芮嗖A。
