沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德市)
應用優勢
1.正交法進行藥物雜質分析
2.用于藥物雜質分析的 UPC2 方法
3.對雜質采用超臨界流體色譜分析符合 ICH 指南和法規要求
沃特世解決方案
ACQUITY UPC2™系統
ACQUITY UPC2色譜柱套裝
Empower® 3軟件
ACQUITY® SQD質譜儀
關鍵詞
UPC2，藥物雜質，穩定性指示方法，降解分析，方法開發，甲氧氯普胺，合相色譜
簡介
超高效合相色譜 (UPC2™)以亞2 µm顆粒為固定相，采用超臨界流體二氧化碳作為主要流動相成分。合相色譜是一種使用少量溶劑即可實現高速分析的分析工具，尤其是在分析雜質時，相比于反向液相色譜(LC)，合相色譜的正交方法更有利于發現未知雜質。合相色譜的方法開發不同于液相和氣相色譜的方法開發策略，后者已經基本成熟。為了簡化這個過程，我們需要研究一種系統的方法，用于開發非手性物質的合相色譜方法。
了解藥品和藥物材料中的雜質分布是一個重要步驟，樣品純度的評估可幫助制藥公司在藥物開發過程中做出決策，推進藥物上市進程。雜質分布將確定供應商所提供原材料的質量、成品的保質期、合成途徑和防止偽造的知識產權保護。色譜圖的正交對比有助于生產商作出最明智的決策。在本應用紀要中，實驗采用ACQUITY UPC2系統分析甲氧氯普胺及其相關雜質。如圖1所示，甲氧氯普胺(胃復安)是一種止吐藥，可以治療胃灼熱、胃潰瘍以及由化療導致的惡心。方法開發研究了色譜柱和溶劑，以確定優化特異性和峰形的合適方法條件。
圖1. 甲氧氯普胺的化學結構。
實驗
UPC2條件
系統：配備PDA和SQD檢測器的ACQUITY UPC2系統
色譜柱：ACQUITY UPC2 BEH 2-EP 3.0 × 100 mm，1.7 µm
流動相A：CO2
流動相B：含1 g/L甲酸銨的甲醇/乙腈(50:50)溶液，加2%的甲酸
清洗溶劑： 70:30的甲醇/異丙醇
分離模式：梯度;溶劑B在5.0 min內由2%增加至30%;達到30%后，保持1 min
流速：2.0 mL/min
CCM 反壓：1500 psi
柱溫：50 ℃
樣品溫度：10 ℃
進樣體積： 1.0 µL
運行時間： 6.0 min
檢測條件： PDA 3D通道：PDA，200到410 nm;20Hz
PDA 2D通道：270 nm，4.8 nm分辨率(補償500到600 nm)SQD MS：150到1200 Da;ESi+和ESi-
補液流速：不需要
數據管理： Empower 3軟件
樣品描述
分離度溶液由甲氧氯普胺和八種相關雜質制備而成，將其置于TruView™最大回收樣品瓶中等待進樣，如表1所示。雜質的濃度為甲氧氯普胺標準品濃度的0.1% w/w。分離度溶液用于色譜分析方法開發。
表1. 甲氧氯普胺雜質標準品、峰的名稱、質量數和歐洲藥典分類列表。
結果與討論
系統篩選
方法開發過程對色譜柱、改性劑和改性添加劑進行了系統篩選，以獲得最佳分離結果。初始的配置通過四種改性劑對四種UPC2色譜柱進行了篩選。“改性劑”是強溶劑流動相，有利于洗脫極性較強的分析物。所使用的四種溶劑分別是甲醇、含0.5%甲酸的甲醇、含2 g/L甲酸銨的甲醇和含0.5%三乙胺的甲醇。篩選過程采用溶劑B在5 min內從5%增加至30%，達到30%時保持1 min的常用梯度。總篩選時間僅兩個多小時。對比各色譜柱所得峰可以發現，含有甲酸銨的甲醇總體上可提供最好的峰形，如圖2所示。方法篩選過程中通過查看ACQUITY SQD提供的質譜圖實現峰跟蹤。對于極性較強的分析物，選擇性(α)有很大不同。在這些對比實驗中，流動相保持恒定，因而不斷變化的α是由[固定相 – 溶質]相互作用所導致。
圖2. 色譜柱篩選結果。改性劑(B)是含有2 g/L甲酸銨的甲醇。溶劑B在5 min內從5%增加至30%，達到30%時保持1 min。
基于這些結果，UPC2 2-EP固定相是最佳的色譜柱選擇，可以為大多數分析物提供更好的峰形和分離度。UPC2 CSH Flouro-Phenyl色譜柱可以提供較好的選擇性和峰形;但是，雜質C未能按預期分離成兩個峰。這種未知現象將在未包括在本應用紀要中的另一組實驗中進一步考察。1
梯度斜率的影響
在反相LC中，梯度斜率是控制選擇性和分離度的常用工具。使用UPC2 2-EP固定相，延長總的梯度運行時間可以降低梯度斜率。斜率的改變對色譜圖基本沒有影響，僅使峰6和7之間的選擇性發生改變，如圖3所示。
圖3. 歸一化的x軸疊加顯示甲氧氯普胺，采用延長的12 min和35 min梯度運行時間，其斜率較6 min的篩選實驗更小。使用原始梯度;溶劑B由5%增加至30%。
不同洗脫溶劑的影響
使用變化率較平緩的梯度并未增加峰與峰之間的分離度。為提高分離度，將低極性非質子有機溶劑(乙腈)與甲醇(極性較強的洗脫溶劑)以不同比例混合。乙腈的添加提高了分離度，擴展了峰之間的分離間隔。這些現象證明本方法可在方法開發中發揮重要作用，如之前發表的結果所示。1
圖4. 如疊加圖中突出部分所示，在改性劑成分中添加乙腈后，后部洗脫分析物的分離度明顯提高。
在添加劑篩選過程中，我們也考察了每種雜質各自的標準品。甲酸可以優化雜質H的峰形;但是，它會影響其它相關物質的色譜分析性能。添加劑的濃度也會對峰形產生影響。為了得到更理想的峰形，濃度需要高于反向LC的常用濃度。增加甲酸的濃度可以進一步改善雜質H的峰形，如圖5所示。但是，雜質F的峰形受到了影響，如圖6所示。組合使用甲酸和甲酸銨可同時獲得兩種添加劑的優勢，使全部的分離均獲得最佳峰形。在改性劑中使用添加劑甲酸和/或甲酸銨對過期樣品進行分析所得結果如圖7所示。在此對比實驗中使用過期樣品使我們能夠更好地評估已知雜質在存在未知雜質條件下的選擇性和峰形。如圖7所示，解決峰形問題最終會影響色譜分離的效率、分離度和靈敏度。
圖7. 過期甲氧氯普胺樣品的分析，改性劑中分別添加不同的添加劑成分。將甲酸銨和甲酸組合，稱之為“類緩沖液”系統，此系統可使樣品中的所有分析物均獲得最佳峰形。所使用的改性劑為50:50的甲醇/乙腈。
評估特異性
在確定可對選擇性、分離度和峰形產生積極影響的方法條件后，各變量同時獲得了優化。實驗使用甲氧氯普胺和雜質(對照)的標準混合物和過期的樣品混合物對最終方法進行了評估，如圖8所示。有關未知雜質的進一步考察，請參閱沃特世(Waters® )應用紀要。2
圖8. 采用“實驗”部分中列出的最終方法條件對甲氧氯普胺對照混合物和降解混合物進行的對比分析。
結論
本實驗使用ACQUITY UPC2系統成功對甲氧氯普胺及其相關物質進行了非手性分析。了解雜質結構的特性有利于方法開發。實驗中分析的多種雜質包括胺類、羥基、酯類和羧酸。能夠影響選擇性、分離度和峰完整性的主要方法變量分別是固定相、改性劑的洗脫強度和添加劑的組成。最后甲氧氯普胺相關物質的分析方法展示了此方法對過期甲氧氯普胺樣品的特異性。
本方法開發過程通過色譜柱篩選處理中的對比實驗揭示了多種[固定相 – 分析物]相互作用。更多的相互作用需要在已發表的研究基礎3-6上進行進一步的探索。了解這些方法變量相互作用的影響將有助于創建一種更加適用的方法開發技術。
參考文獻
1. Jones MD, et al.Analysis of Organic Light Emitting Diode Materials by UltraPerformance Convergence C hromatography Coupled with Mass Spectrometry (UPC2 /MS).Waters Application Note 720004305EN.2012 April.
2. Jones MD, et al.Impurity Profiling Using UPC2 /MS. Waters Application Note 720004575EN.2013 Jan.
3. West C, Lesellier E. A unified classification of stationary phases for packed column supercritical fluid c hromatography.J Chromatogr A. 2008 May;1191(1-2):21-39.
4. West C, K hater S, Lesellier E. C haracterization and use of hydrophilic interaction liquid c hromatography type stationary phases in supercritical fluid c hromatography.J Chromatogr A. 2012 Aug; 1250:182-95.
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