Kaori Taguchi、 Eiichiro Flukusaki 和 Takeshi Bamba
1 沃特世公司(美國馬薩諸塞州米爾福德市)
2 日本吹田市，大阪大學，生物技術系
目的
利用UltraPerformance Convergence Chromatography™ (UPC2™)超高效合相色譜建立一種可快速進行膽汁酸分析和定量的新方法。
背景
膽汁酸作為一種信號分子，在調節甘油三酯、膽固醇和葡萄糖代謝中扮演著重要的角色。 這些信號通路已經成為開發治療代謝性疾病藥物的靶點。此外，膽汁酸還可用作血清中揭示肝臟疾病和膽汁酸調控代謝機制的生物標志物。因此，建立一種可測定體內膽汁酸的分析方法具有重要意義。
由于結構類似物(如同分異構體)的存在，以及非結合型和結合型膽汁酸之間的極性差異使得膽汁酸的分離尤為復雜。過去，研究人員采用氣相色譜(GC)和液相色譜(LC)分析這些化合物，但這些方法都存在一定的局限性。GC法通常需要進行步驟繁瑣的衍生化處理，且衍生化的每個步驟中都會損失一定量的膽汁酸。此外，采用GC分析法測定結合型膽汁酸的成分或濃度時，需對若干等分的樣品分別進行提取。
采用超高效合相色譜串聯ESI-MS/MS系統，可在13 min內同時分析25種膽汁酸。
圖1. 13 min內同時分析25種膽汁酸標準品混合物，包括甘氨酸和牛磺酸結合物。各MRM色譜圖中的化合物名稱按保留時間順序標示。
圖2. 采用UPC2/MS系統對大鼠血清中的膽汁酸進行定量測定(n=6)。
雖然LC分析法可同時檢測結合型和非結合型膽汁酸，但單針分析時間長達30min。在本應用紀要中，我們將介紹一種可快速進行膽汁酸分析和定量的UPC2/MS方法。
解決方案
本實驗利用Waters® ACQUITY UPC2™系統，以超臨界二氧化碳(SCCO2)為主要流動相建立了一種可同時分離25種不同膽汁酸(包括其結合物在內)的方法。以SCCO2為流動相可加速分析物的擴散并降低反壓，從而縮短分析時間。為了提高分析的靈敏度和特異性，我們將ACQUITY UPC2系統與Xevo® TQ-S質譜儀聯用。25種不同的膽汁酸(包括甘氨酸和牛磺酸結合物)的分離結果見圖1。
所有的膽汁酸在13 min內實現分離，與此前的分析方法相比，分析時間縮短了約2倍。采用不同的固定相、柱溫設置、添加劑以及不同pH值的改性劑的組合對方法進行優化。Xevo TQ-S的檢測模式設置為ESI負離子模式，無需使用尾吹氣即可獲得最大靈敏度。
使用這一方法對實際生物樣品(大鼠血清)中的膽汁酸及其結合物進行定量分析。使用甲醇按甲醇：血清3:1(v/v)的比例對購得的大鼠血清進行去蛋白處理，再進行渦旋和離心。取上清液注入UPC2/MS/MS，測定血清樣品中各膽汁酸及其結合物的濃度。結果如圖2所示，表明本方法可測定生物基質中各膽汁酸及其結合物的水平，且重現性良好。
總結
采用超高效合相色譜(UPC2)串聯ESI-MS/MS系統，可同時分析生物基質中的25種膽汁酸與其結合物。采用亞2μm填料的色譜柱，在13 min內實現所有分析物的分離，分離度滿足要求。本應用紀要證明：這一新的分離方法非常適合評價膽汁酸對甘油三酸酯、膽固醇和葡萄糖代謝的影響，并可促進治療代謝性疾病的新型藥物靶點的開發。
