(一) 準備工作
1.在開始工作以前，要清除生物安全柜內表面的污染。
2.將所有必需的物品置于安全柜內，以盡可能減少雙臂進出前面開口的次數。物品放置要注意以下幾點：
①II級生物安全柜臺面前面和后面的進氣格柵不能被物品阻擋。
②所有物品應盡可能地放在工作臺后部靠近工作臺邊緣的位置，并使其在操作中不會阻擋后部格柵。
③可產生氣溶膠的設備(如：混勻器、離心機等)應靠近安全柜的后部放置。有生物危害性的廢棄物袋、盛放廢棄吸管的盤子等體積較大的物品，應該放在安全柜內的某一側。
④潔凈的物品應放置在距離產生氣溶膠器皿至少15 cm外，降低交叉污染的可能性。
⑤容易受紫外線損傷的實驗樣本可以在紫外線殺菌后的實驗之前放入。
⑥不要在工作區內排放過多的物品。
3.關閉操作前窗，打開生物安全柜的紫外燈，對生物安全柜工作臺面，側壁表面以及后壁內側進行殺菌處理。
4.稍微打開操作前窗，讓生物安全柜工作區排氣幾分鐘之后再開始工作。
(二) 操作注意事項
1.在使用生物安全柜時應穿著個體防護服并戴手套防止被污染。在進行一級和二級生物安全水平的操作時，可穿著普通實驗服。手套應套在實驗服袖口外面。有些操作可能還需要戴口罩和護目鏡。
2.在生物安全柜內，避免使用酒精燈等明火滅菌器。使用明火會對氣流產生影響，并且在處理揮發性物品和易燃物品時，也易造成危險。在對接種環進行滅菌時，可以使用紅外線電加熱器,或者干脆使用一次性塑料接種環。
3.手和雙臂伸入到生物安全柜中等待大約1min,以便安全柜調整完畢并且讓里面的空氣“掃過”手和雙臂的表面以后，才可以開始對物品進行處理。
4.工作時，盡量減少手臂的移動，移動時要緩慢，防止干擾柜內氣流。在移動雙臂進出安全柜時，需要小心維持前面開口處氣流的完整性，雙臂應該與工作區開口垂直地緩慢進出前面的開口。
5.在工作臺面上的實驗操作應該按照從清潔區到污染區的方向進行，所有操作在工作臺面的中后部進行。
6.工作時，耐高壓滅菌的生物危害性廢棄物袋以及吸管盛放盤放在安全柜內不能拿出安全柜，否則在使用這些物品時雙臂就必須頻繁進出安全柜，這樣會干擾安全柜空氣屏障的完整性，從而影響對人員和物品的防護。
7.一旦實驗過程中產生溢灑物，用消毒紙巾置于其表面吸附清理。
8.盡量使安全柜處于持續工作狀態，并對所有物品進行表面消毒處理，提供最大程度的人員保護。從安全柜內部拿取可能產生污染的物品時，一定要進行表面消毒處理。
(三)使用完畢后的處理
1.系緊用過的生物廢物袋。
2.對安全柜內壁、后壁、工作臺面和前窗內側進行清潔和消毒處理。
3.由于剩余的培養基可能會使微生物生長繁殖，因此在實驗結束時，包括儀器設備在內的所有物品都應清除表面污染，并移出安全柜。
4.從安全柜內移出手臂之前，一定要進行表面消毒處理，然后垂直于工作區開口緩慢地移出。
6.在每次使用后，要清除生物安全柜內表面的污染。工作臺面和內壁要用消毒劑進行擦拭，所用的消毒劑要能夠殺死安全柜里的任何微生物。在每天實驗結束時，應擦拭生物安全柜的工作臺面、四周以及玻璃的內外側等部位來清除表面的污染。在對目標生物體有效時，可以采用漂白劑溶液或70%酒精來消毒。在使用如漂白劑等腐蝕性消毒劑后，還必須用無菌水再次進行擦拭。
7.關閉前操作窗口并開啟紫外燈。
(四)生物安全柜內溢灑的處理
處理溢灑物時不要將頭伸入安全柜內，也不要將臉直接面對前操作口，而應處于前視面板的后方。選擇消毒滅菌劑時需要考慮其對生物安全柜的腐蝕性。
如果溢灑的量不足1 ml時，可直接用消毒滅菌劑浸濕的紙巾(或其他材料)擦拭。
如果溢灑量大或容器破損，建議按如下操作：使生物安全柜保持開啟狀態；在溢灑物上覆蓋浸有消毒滅菌劑的吸收材料，作用一定時間以發揮消毒滅菌作用，必要時，用消毒滅菌劑浸泡工作表面以及排水溝和接液槽；在安全柜內對所戴手套消毒滅菌后，脫下手套；如果防護服已被污染，脫掉所污染的防護服后，用適當的消毒滅菌劑清洗暴露部位；穿好適當的個體防護裝備，如雙層手套、防護服、護目鏡和呼吸保護裝置等；小心將吸收了溢灑物的紙巾(或其他吸收材料)連同溢灑物收集到專用的收集袋或容器中，并反復用新的紙巾(或其他吸收材料)將剩余物質吸凈；破碎的玻璃或其他銳器要用鑷子或鉗子處理；用消毒滅菌劑擦拭或噴灑安全柜內壁、工作表面以及前視窗的內側；作用一定時間后，用潔凈水擦干凈消毒滅菌劑；如果需要浸泡接液槽，在清理接液槽前要先報告主管人員；可能需要用其他方式消毒滅菌后再進行清理。如果溢灑物流入生物安全柜內部，需要評估后采取適用的措施。
(五)定期維護
1.每三個月更換一次預過濾器。
2.每年更換一次紫外燈。
3.有下列情況之一時，應對生物安全柜進行現場檢測：生物安全實驗室竣工后，投入使用前，生物安全柜已安裝完畢；生物安全柜被移動位置后；對生物安全柜進行檢修后；生物安全柜更換高效過濾器后；生物安全柜一年一度的常規檢測。現場檢測應由有資質的專業人員按照生產商的說明對每一臺生物安全柜的運行性能以及完整性進行評估，以檢查其是否符合國家標準要求。安全柜防護效果的評估應該包括對安全柜的完整性、HEPA過濾器的泄漏、垂直氣流的速度、工作窗口氣流流向和平均風速、負壓/換氣次數、氣流的煙霧模式以及警報和互鎖系統進行測試。還可以選擇進行漏電、光照度、紫外強度、噪音水平以及振動性測試。在進行這些測試時，檢測人員要經過專門的培訓，采用專門的技術和儀器設備。強烈建議由有資質的專業人員來進行測試。
每周采用空氣落菌數相似的方法進行無菌檢查。
生物安全柜在移動以及更換過濾器之前，必須清除污染。最常用的方法是采用甲醛熏蒸,應該由有資質的專業人員來清除污染。
