高通量測序的推出背景：
2004年全球多個國家共計預算30億美金的人類基因組測序完成以后，發現單單完成一個人的基因組序列還遠遠不足以理解人類自身及疾病的機理。由于有了已經完成的人類基因組當做參考基因組，采用廉價、快速的方法對多個樣本、群體、病種基因組的比對測序就能提供大量有價值的科研和臨床信息。這就要求測序價格足夠低、速度足夠快，然而對測序結果是否易于拼接、組裝基因組則沒有明確需求。于是，美國國家基因組研究院(NHGRI)提出了把全基因組測序降至1000美金的研究規劃，從而引領科學界、企業界大力發展測序技術。
高通量測序的十年：
2005年，454公司首先推出了二代測序儀;2006年，Solexa推出了Genome Analyzer，2007年年初Illumina收購了Solexa公司，在隨后的幾年陸續推出了Hiseq2000、MiSeq、Hiseq2500、MiseqDx、NextSeq 500測序儀，占據了高通量測序的大部分市場。ABI也在2007年推出的是SOLiD測序平臺，隨后收購了454測序儀發明者創立的Ion Torrent，轉而大力推廣PGM和Ion Proton平臺。2014年，也就是高通量測序技術發展的第十年，illumina公司的Hiseq X平臺已經實現了1000美金一個人類基因組測序的目標。雖然這個價格的實現，需要在保證未來數年充足機時的情況下才能完成，但也比十年前的30億美金降低了300萬倍。除此以外，還有好多公司開發了第三代測序儀，比如Pacific Biosciences的PacBio RS測序儀，DNA模板無需二代測序常用的PCR擴增的方法，就可以實現長讀長、實時的測序;Oxford Nanopore MinION測序儀只有USB存儲器那么大等等。
2013年9月，illumina公司的MiseqDx平臺，首次通過了美國FDA的技術認證，作為開放平臺和囊纖維化的試劑產品準許進入臨床，標志著經過10年的發展，高通量測序技術已從純科學研究的平臺進入臨床診斷領域。
各代測序的應用范圍：
一代測序(Sanger)適合單一片段，長度小于800bp的精準測序;二代適合快速、低價測量海量數據，每次測序能產生數百、數千萬條序列，但讀長不超過500bp;而以PacBio為代表的三代測序更適合單分子測序，最長可以到幾十K的讀長，但測序質量略低。所以目前還沒有哪一代測序技術可以完全取代同類技術，并不能簡單的通過名字來判斷技術先進性，重要的還是各個平臺都有各自最適合的應用領域。
高通量測序應用范圍：
無需BAC文庫構建就可以進行全基因組鳥槍法沖測序;數以千萬計的序列同時測序;測序結果無需通過毛細管電泳獲得等等特點決定了高通量測序儀具有廣闊的應用范圍：基因組從頭測序、基因組重測序、目標片段測序、數字化基因表達譜、小RNA測序、甲基化測序、蛋白質DNA相互作用測序等等。本文主要就高通量測序的幾個應用在臨床診斷領域的開展做一個簡單介紹。
高通量測序的臨床應用：
1.染色體疾病檢測
2008年香港中文大學的盧煜明和斯坦福的Stephen Quake先后發表文章提出通過檢測母體外周血中的游離DNA，可以準確的判斷該孕婦胎兒的染色體非整倍體，該技術無需常規的羊膜腔穿刺、絨毛膜穿刺等創傷性染色體疾病檢測技術，故常被簡稱為無創產前檢測。
無創染色體檢測的技術核心為拷貝數變異的原理。測序所得的序列通過生物信息算法，把所有序列比對到人類參考基因組。通過計數每一個染色體的唯一對應的序列條數來獲取全染色體拷貝數變異情況。如果其中有一個染色體增加一條或缺少一條，則該染色體的拷貝數會顯著增加或減少。
在當前常見的無創染色體非整倍體檢測中，主要針對T21、T18、T13這三個染色體三體綜合征。從國內外各家公司公布的數字來看，準確率、陽性預測值都可以達到99%。相對血清唐氏篩查技術，無創技術大大提高了準確率，降低了假陽性率。從而推動產前檢測技術極大的發展，也幫助高通量測序真正的進入了臨床轉化應用階段。在染色體非整倍體疾病中，性染色體異常(XXX、XO、XXY)等也頗為常見，由于X染色體(155mb)相對Y染色體(60mb)要大很多，血漿游離DNA中母體的DNA含量占50~90%，從而造成無創檢測性染色體異常 具有一定的難度，準確率基本在90%左右。
除了染色體非整倍體以外，染色體病還有微缺失微重復，是指染色體上有局部片段缺失或出現重復片段。常見的表現為染色體上的部分三體、部分單體，比如貓叫綜合征、迪格奧爾格綜合征(Digeorge) 、Wolf-Hirschhorn syndrome、Prader-Willi syndrome等等。自從高通量測序技術應用于無創產前檢測，業界也開始使用該技術來檢測微缺失微重復。由于微缺失微重復染色體改變相對較小，需要較深的測序深度，才能較準確的判斷染色體變異情況。
以上提到的都是無創的方式去檢測染色體非整倍及微缺失微重復。對于診斷篩查成年人、嬰幼兒、流產組織等染色體變異情況，利用高通量測序也是一種很好的選擇，相對于傳統的Array CGH，高通量測序技術更準確、速度更快、檢測分辨率更高，需要的起始樣本量更低，只要幾納克。
產前檢測領域具有很大的特殊性，每一個結果都會影響一個還未出生的小生命，對于檢測的準確率相對其他檢測技術要求要高很多。不管是假陰性還是假陽性，都要求盡可能的低，否則會引起很多臨床糾紛。而且由于要給后續的產前診斷技術正確盡可能多的時間，所以就要求檢測周期盡可能短。無創染色體檢測需要每一個樣本有一定的測序量，但并不是簡單的說測序越深結果就一定越好，需要保證每批測序的穩定性，就對實驗室流程控制、試劑盒本身的質量控制、數據分析的校正都提出了很高的要求。如果沒有很好的控制，哪怕一臺測序儀就跑一個樣本，幾十倍于常規的測序通量，也不一定就能準確判斷結果陰陽性。
2.基因突變檢測
不同于一代測序針對單一片段的測序檢測基因突變，高通量測序往往可以針對一個基因多個位點、多個基因或全外顯子突變的快速檢測。在這類檢測中，首先通過PCR或者探針捕獲的方式富集待檢區域的DNA，然后通過高通量測序儀進行測序。高通量測序的準確率不如一代測序，所以為了得到準確的結果，每一個堿基位置都需要至少100條以上的序列結果。由于一個或多個基因位點組合、哪怕是全基因組外顯子組合，也就70mb左右的DNA區域，實際工作中很容易實現100X以上的測序深度，往往都可以達到1000X以上。
表皮生長因子受體(EGFR)基因突變檢測為當前最常用的單基因突變檢測，檢測結果可用于輔助臨床醫生篩選可受益于易瑞沙、特羅凱和凱美納等靶向藥物的非小細胞肺癌患者。目前常用的方法為熒光定量技術，需要做多個反應。根據Ensembl的數據庫，EGFR最長的編碼形式有28個外顯子，編碼區共有9821個堿基，不管是一代測序還是熒光定量都很難一次把EGFR全部位點都檢測到。而針對10K的區域，對于高通量測序來說只需完成10mb測序量(1000X)就可以精確檢測所有位點的信息。目前市場上主流的高通量測序儀一次測序都可以完成10G~1.8T，也就說可以一次開機至少可以完成1000個以上病人的樣本。
對于單基因的檢測，除非這個基因很長，或者具有大片段的缺失、重復，否則用高通量測序來做單基因檢測有點大材小用，現實臨床檢驗工作中要短時間聚齊1000個病人的樣本也頗有難度，樣本太少的話單個樣本的平攤成本就會劇增。因此對于基因突變檢測，高通量測序技術更適合多基因組合、甚至全外顯子捕獲等測序方式。
3.微生物、病毒、細菌鑒定
采用PCR方式來鑒定微生物、病毒、細菌非?？旖?、廉價，但是需要利用已知物種的DNA序列設計PCR引物探針，對于未知物種則一籌莫展;一代測序的方法是可以鑒定未知物種，但是樣本要求是經過分離培養，DNA背景單一，混合多個物種的DNA樣本，一代測序會產生大量雜峰而無法正常得出測序結果。而高通量測序無需做任何培養、分離、也無需事先知曉物種，只要把待測樣本的基因組DNA構建測序文庫，測序產生數十萬~數千萬條不同的DNA序列，即可以輕易知道待測樣本中有何種微生物、病毒、細菌、每一個物種的比例、堿基是否有突變、是否為新物種。
2009年H1N1病毒爆發感染時，有一名病人死于呼吸系統引起的多器官衰竭，然而并不知道具體的死因。科學家把病人的肺部穿刺組織的DNA拿來做高通量測序。最終在950萬條序列中，含有0.85%的序列來自于H1N1病毒基因組，從而幫助科學家發現了該病人的真正死因。在這樣高人類基因組干擾的背景下，目前其他技術都難以快速發現致病病毒序列、以及分子分型。
結核桿菌感染現在越來越嚴重，由于結核桿菌生長緩慢，發現結核桿菌感染及分子分型往往需要數月的時間。而結核桿菌的基因組只有4.4mb，利用高通量測序儀可以非常早期發現結核桿菌感染，同時還可輕易測得結核桿菌基因組的大部分區域，便于選擇合適的敏感藥物，以及確定是否為全新分子分型。
腸道微生態為目前熱門的研究領域，在腸道內微生物種類眾多，各菌群的種類和比例會影響人體的建庫、代謝情況。高通量測序儀也是該領域的唯一選擇。
4.腫瘤相關檢測
除了前述的腫瘤基因突變檢測以外，在血漿中尋找腫瘤組織脫落的DNA片段，對早期發現腫瘤、監控術后復發等領域被寄予厚望。血漿中大部分為正常組織的脫落細胞DNA，如果有腫瘤發生，異常增生的細胞脫落外周血循環，降解成低豐度DNA片段，由于含量低、碎片化DNA，基因芯片和PCR都不能正常檢測。在無創產前檢測的技術流程上做分析優化，高通量測序技術可精確檢測游離DNA的每一個堿基，從而發現是否有腫瘤突變基因存在。美國霍普金斯大學也曾提出，首先對手術腫瘤組織進行全基因組深度測序，發現個體化的腫瘤基因組融合片段，隨后在外周血中利用實時熒光PCR方法檢測該個體化基因組融合片段的豐度，如果豐度提高則提示腫瘤有轉移、復發的可能。
總結
十年來，高通量測序慢慢從實驗室進入了臨床檢驗，展現了蓬勃的生機及想象空間，未來肯定還有很多新的檢測項目有待開發。10年來，高通量測序的單堿基成本已經降低了數百倍，也許在不久的將來，每一個新生兒都會有自己的基因組序列。海量數據的產生，也會反過來幫助近幾年遭遇瓶頸的藥物研發機構，研發更多的個體化藥物。
高通量測序本身還有很多局限性，一次測序需要多個樣本混合、成本還是相對昂貴、數據分析具有挑戰性、操作環節多。企業界、科學界都在解決測序儀的穩定性、樣本處理的便捷性、一體化數據分析等等問題。就像二代測序技術無法取代一代測序一樣，高通量測序技術也無法取代PCR、FISH等其他類型的分子診斷技術。高通量測序技術會成為未來分子診斷領域的重要組成部分，大大推動技術前進。
