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植物組織培養(yǎng)中常用滅菌方法

   2025-07-30 北京啟維益成科技有限公司試劑部1112

     常用的滅菌方法可分為物理的和化學(xué)的兩類,即:物理方法如干熱(烘燒和灼燒)、濕熱(常壓或高壓蒸煮)、射線處理(紫外線、超聲波、微波)、過濾、清洗和大量無菌水沖洗等措施;化學(xué)方法是使用升汞、甲醛、過氧化氫、高錳酸鉀、來蘇水、漂白粉、次氯酸鈉、抗菌素、酒精化學(xué)藥品處理。這些方法和藥劑要根據(jù)工作中的不同材料不同目的適當(dāng)選用。

1、培養(yǎng)基用濕熱滅菌
培養(yǎng)基在制備后的24小時(shí)內(nèi)完成滅菌工序。高壓滅菌的原理是:在密閉的蒸鍋內(nèi),其中的蒸汽不能外溢,壓力不斷上升,使水的沸點(diǎn)不斷提高,從而鍋內(nèi)溫度也隨之增加。在0.1mpa的壓力下,鍋內(nèi)溫度達(dá)121℃。在此蒸汽溫度下,可以很快殺死各種細(xì)菌及其高度耐熱的芽孢。

注意完全排除鍋內(nèi)空氣,使鍋內(nèi)全部是水蒸氣,滅菌才能徹底。高壓滅菌放氣有幾種不同的做法,但目的都是要排凈空氣,使鍋內(nèi)均勻升溫,保證滅菌徹底。常用方法是:關(guān)閉放氣閥,通電后,待壓力上升到0.05mpa時(shí),打開放氣閥,放出空氣,待壓力表指針歸零后,再關(guān)閉放氣閥。

關(guān)閥再通電后,壓力表上升達(dá)到0.1mpa時(shí),開始計(jì)時(shí),維持壓力0.1-0.15mpa,20分鐘。
按容器大小不同,保壓時(shí)間有所不同。見表1。該表所列數(shù)字是徹底滅菌很保險(xiǎn)的數(shù)字,如果容器體積較大,但是放置的數(shù)量很少,也可以減少時(shí)間。

表1. 培養(yǎng)基高壓蒸汽滅菌所必需的最少時(shí)間

容器的體積/ml
在121℃滅菌所需最少時(shí)間/min
20-50
15
75-150
20
250-500
25
1000
30
 
到達(dá)保壓時(shí)間后,即可切斷電源,在壓力到0.5mpa,可緩慢放出蒸汽,應(yīng)注意不要使壓力降低太快,以致引起激烈的減壓沸騰,使容器中的液體四溢。當(dāng)壓力降到零后,才能開蓋,取出培養(yǎng)基,擺在平臺(tái)上,以待冷凝。不可久不放氣,引起培養(yǎng)基成分變化,以至培養(yǎng)基無法擺斜面。一旦放置過久,由于鍋爐內(nèi)有負(fù)壓,蓋子打不開,只要將放氣閥打開,大氣壓入,內(nèi)外壓力平衡,蓋子便易打開了。

對高壓滅菌后不變質(zhì)的物品,如無菌水、栽培介質(zhì)、接種工具,可以延長滅菌時(shí)間或提高壓力。而培養(yǎng)基要嚴(yán)格遵守保壓時(shí)間,既要保壓徹底,又要防止培養(yǎng)基中的成分變質(zhì)或效力降低,不能隨意延長時(shí)間。

對于一些布制品,如實(shí)驗(yàn)衣、口罩等也可用高壓滅菌。洗凈晾干后用耐高壓塑料袋裝好,高壓滅局20-30分鐘。
高壓滅菌前后的培養(yǎng)基,其ph值下降0.2-0.3單位。高壓后培養(yǎng)基ph值的變化方向和幅度取決于多種因素。培養(yǎng)基中成分單一時(shí)和培養(yǎng)基中含有高或較高濃度物質(zhì)時(shí),高壓滅菌后的ph值變化幅度較大,甚至可大于2個(gè)ph值單位。環(huán)境ph值的變化大于0.5單位就有可能產(chǎn)生明顯的生理影響。

高壓滅菌通常會(huì)使培養(yǎng)基中的蔗糖水解為單糖,從而改變培養(yǎng)基的滲透壓。在8%-20%蔗糖范圍內(nèi),高壓滅菌后的培養(yǎng)基約升高0.43倍。

培養(yǎng)基中的鐵在高壓滅菌時(shí)會(huì)催化蔗糖水解,可使15%-25%的蔗糖水解為葡萄糖和果糖。培養(yǎng)基值小于5.5,其水解量更多,培養(yǎng)基中添加0.1%活性炭時(shí),高壓下蔗糖水解大大增強(qiáng),添加1%活性炭,蔗糖水解率可達(dá)5%。

為防止高壓滅菌產(chǎn)生的上述一些變化可用下列方法:
(1)經(jīng)常注意搜集有關(guān)高壓滅菌影響培養(yǎng)基成分的資料,以便及時(shí)采取有效措施。
(2)設(shè)計(jì)培養(yǎng)基配方時(shí)盡量采用效果類似的穩(wěn)定試劑并準(zhǔn)確掌握劑量。如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇,以IBA代替IAA,控制活性炭的用量(在0.1%以下)注意ph值對高壓滅菌下培養(yǎng)基中成分的影響等。
(3)配制培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)注意成分的適當(dāng)分組與加入的順序。如將磷、鈣和鐵放在最后加入。
(4)注意高壓滅菌后培養(yǎng)基ph值的變化及恢復(fù)動(dòng)態(tài)。如高壓滅菌后的ph值常由5.8升高至6.48。而96小時(shí)后又會(huì)降至5.8左右。這樣在實(shí)驗(yàn)中就可以根據(jù)這一規(guī)律加以掌握。

2、用于無菌操作的器械采用灼燒滅菌

在無菌操作時(shí),把鑷子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中,使用之前取出在酒精燈火焰上灼燒滅菌。冷卻后,立即使用。操作中可采用250或500毫升的廣口瓶,放入95%的酒精,以便插入工具。

3、玻璃器皿及耐熱用具采用干熱滅菌
干熱滅菌是利用烘箱加熱到160-180℃的溫度來殺死微生物。由于在干熱條件下,細(xì)菌的營養(yǎng)細(xì)胞的抗熱性大為提高,接近芽孢的抗熱水平,通常采用170℃持續(xù)90分鐘來滅菌。干熱滅菌的物品要預(yù)先洗凈并干燥,工具等要妥為包扎,以免滅菌后取用時(shí)重新污染。包扎可用耐高溫的塑料。滅菌時(shí)應(yīng)漸進(jìn)升溫,達(dá)到預(yù)定溫度后記錄時(shí)間。烘箱內(nèi)放置的物品的數(shù)量不宜過多,以免防礙熱對流和穿透,到指定時(shí)間斷電后,待充分冷涼,才能打開烘箱,以免因驟冷而使器皿破裂。干熱滅菌能源消耗太大,浪費(fèi)時(shí)間。

4、不耐熱的物質(zhì)采用過濾滅菌

一些生長調(diào)節(jié)劑,如赤霉素、玉米素、脫落酸和某些微生物是不耐熱的,不能用高壓滅菌處理,通常采用過濾滅菌方法。

一些化學(xué)成分在高溫高壓下會(huì)發(fā)生降解而失去效能或降低效能。經(jīng)高溫滅菌后赤霉素GA3的活性僅及不經(jīng)高溫滅菌的新鮮溶液的10%。蔗糖經(jīng)高溫后部分被降解成d-葡萄糖和d-果糖,果糖又可被部分水解,產(chǎn)生抑制培養(yǎng)的植物組織生長的物質(zhì)。高溫還可使碳水化合物和氨基酸發(fā)生反應(yīng)。維生素具有不同程度的熱穩(wěn)定性,但如果培養(yǎng)基的ph值高于5.5,則維生素b1會(huì)被迅速降解。泛酸鈣、植物組織提取物等要過濾滅菌,不能高溫滅菌,否則會(huì)失去作用。

防細(xì)菌濾膜的網(wǎng)孔的直徑為0.45微米以下,當(dāng)溶液通過濾液后,細(xì)菌的細(xì)胞和真菌的孢子等因大于濾膜直徑而被阻,在需要過濾滅菌的液體量大時(shí),常使用抽濾裝置;液量小時(shí),可用注射器。使用前對其高壓滅菌,將濾膜裝在注射器的靠針管處,將待過濾的液體裝入注射器,推壓注射器活塞桿,溶液壓出濾膜,從針管壓出的溶液就是無菌溶液。

過濾除菌操作步驟:首先將過濾器、接液瓶用紙包好,濾膜可放在培養(yǎng)皿內(nèi)用紙包好。使用前先經(jīng)121℃高壓蒸汽滅菌30分鐘;在超凈工作臺(tái)上,將濾器裝置裝好,用滅菌無齒鑷子將濾膜安放在隔板上,濾膜粗糙面向上;然后將待除菌的液體注入濾器內(nèi),開動(dòng)真空泵即可過濾除菌。濾液經(jīng)培養(yǎng)證明無菌生長后可保存?zhèn)溆谩?/FONT>

5、空間采用紫外線和熏蒸滅菌

(1)紫外線滅菌在接種室、超凈臺(tái)上或接種箱用紫外燈滅菌。紫外線滅菌是利用輻射因子滅菌,細(xì)菌吸收紫外線后,蛋白質(zhì)和核酸發(fā)生結(jié)構(gòu)變化,引起細(xì)菌的染色體變異,造成死亡。紫外線的波長為200-300nm,其中260nm的殺菌能力最強(qiáng),但是由于紫外線的穿透能力很弱,所以只適于空氣和物體表面的滅菌,而且要求距照射物以不超過1.2米為宜。

(2)熏蒸滅菌用加熱焚燒、氧化等方法,使化學(xué)藥劑變?yōu)闅怏w狀態(tài)擴(kuò)散到空氣中,以殺死空氣和物體表面的微生物。這種方法簡便,只需要把消毒的空間關(guān)閉緊密即可。

化學(xué)消毒劑的種類很多,它們使微生物的蛋白質(zhì)變性,或競爭其酶系統(tǒng),或降低其表面張力,增加菌體細(xì)胞漿膜的通透性,使細(xì)胞破裂或溶解。一般說來,溫度越高,作用時(shí)間越長,殺菌效果越好。另外,由于消毒劑必須溶解于水才能發(fā)揮作用,所以要制成水溶狀態(tài),如升汞與高錳酸鉀。還有消毒劑的濃度一般是濃度越大,殺菌能力越強(qiáng),但石炭酸和酒精例外。

常用熏蒸劑是甲醛,熏蒸時(shí),房間關(guān)閉緊密,按5-8ml/m3用量,將甲醛置于廣口容器中,加5g/m3高錳酸鉀氧化揮發(fā)。熏蒸時(shí),房間可預(yù)先噴濕以加強(qiáng)效果。冰醋酸也可進(jìn)行加熱熏蒸,但效果不如甲醛。

6、一些物體表面用藥劑噴霧滅菌

物體表面可用一些藥劑涂搽,噴霧滅菌。如桌面、墻面、雙手、植物材料表面等,可用75%的酒精反復(fù)涂搽滅菌,1%-2%的來蘇兒溶液以及0.25%-1%的新潔爾滅也可以。

7、植物材料表面用消毒劑滅菌

從外界或室內(nèi)選取的植物材料,都不同程度地帶有各種微生物。這些污染源一旦帶入培養(yǎng)基,便會(huì)造成培養(yǎng)基污染。因此,植物材料必須經(jīng)嚴(yán)格的表面滅菌處理,再經(jīng)無菌操作手續(xù)接種到培養(yǎng)基上,這一過程叫做接種。接種的植物材料叫做外植體(explant)。
啟維益成代理的植物組培抗菌劑(PPM)它是一種廣譜抗微生物劑,可以殺死細(xì)菌和真菌細(xì)胞,防止真菌孢子的萌發(fā),并在較高濃度下能消除內(nèi)源性污染的外植體。
首先,將采來的植物材料除去不用的部分,將需要的部分仔細(xì)洗干凈,如用適當(dāng)?shù)乃⒆拥人⑾础0巡牧锨懈畛蛇m當(dāng)大小,即滅菌容器能放入為宜。置自來水龍頭下流水沖洗幾分鐘至數(shù)小時(shí),沖洗時(shí)間視材料清潔程度而宜。易漂浮或細(xì)小的材料,可裝入紗布袋內(nèi)沖洗。流水沖洗在污染嚴(yán)重時(shí)特別有用。

洗時(shí)可加入洗衣粉清洗,然后再用自來水沖洗洗衣粉水。洗衣粉可除去輕度附著在植物表面的污物,除去脂質(zhì)性的物質(zhì),便于滅菌液的直接接觸。當(dāng)然,最理想的清洗物質(zhì)是表面活性物質(zhì)吐溫。

第二步是對材料的表面浸潤滅菌。要在超凈臺(tái)或接種箱內(nèi)完成,準(zhǔn)備好消毒的燒杯、玻璃棒、70%酒精、消毒液、無菌水、手表等。用70%酒精浸泡10-30秒。由于酒精具有使植物材料表面被浸濕的作用,加之70%酒精穿透力強(qiáng),也很易殺傷植物細(xì)胞,所以浸潤時(shí)間不能過長。有一些特殊的材料,如果實(shí)、花蕾、包有苞片、苞葉等的孕穗,多層鱗片的休眠芽等等,以及主要取用內(nèi)部的材料,則可只用70%酒精處理稍長的時(shí)間。處理完的材料在無菌條件下,待酒精蒸發(fā)后再剝除外層,取用內(nèi)部材料。

第三步是用滅菌劑處理。表面滅菌劑的種類較多,可根據(jù)情況選取1-2種使用(表2)。

表2. 常用滅菌劑使用濃度及效果比較

滅菌劑名稱
使用濃度
滅菌時(shí)間/min
滅菌效果
酒精
70-75%
0.1-3
氯化汞
0.1-0.2%
2-10
很好
漂白粉
飽和溶液%
5-30
很好
次氯酸鈣
9-10%
5-30
很好
次氯酸鈉
2%
5-30
很好
過氧化氫
10-12%
5-15
抗菌素
4-50mg/L
30-60
較好
 
上述滅菌劑應(yīng)在使用前臨時(shí)配制,氯化汞可短期內(nèi)儲(chǔ)用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來殺菌的,故滅菌時(shí)用廣口瓶加蓋較好;升汞是由重金屬汞離子來達(dá)到滅菌的;過氧化氫是分解中釋放原子態(tài)氧來殺菌的,這種藥劑殘留的影響較小,滅菌后用無菌水漂洗3-4次即可;由于升汞液滅菌的材料,難以對升汞殘毒去除,所以應(yīng)當(dāng)用無菌水漂洗8-10次,每次不少于3分鐘,以盡量去除殘毒。

滅菌時(shí),不瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中,記好時(shí)間,倒入消毒溶液,不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng),以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸,驅(qū)除氣泡,使消毒徹底。在快到時(shí)間之前1-2分鐘,開始把消毒液傾入一備好的大燒杯內(nèi),要注意勿使材料倒出,傾倒干凈后立即倒入無菌水,輕攪漂洗。滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開始,至倒入無菌水時(shí)為止。記錄時(shí)間還便于比較消毒效果,以便改正。滅菌液要充分浸沒材料。寧可多用些滅菌液,切勿勉強(qiáng)在一個(gè)體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。

在滅菌溶液中加吐溫-80或triton X效果較好,這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布,更容易浸入到滅菌的材料表面。但吐溫加入后對材料的傷害也在增加,應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間,一般加入滅菌液的0.5%,即在100ml加入15滴。

最后一步是用無菌水漂洗,漂洗要求3分鐘左右,視采用的消毒液種類,漂洗3-10次左右。無菌水漂洗作用是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。 
 
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