病理學技術（組織標本切片和染色技術）是組織學、病理學等學科用于觀察和研究組織與細胞的正常形態及病理變化的常用方法。 

組織經過固定、切片和染色后，光波通過被檢組織成分時，波長和振幅發生改變，在顯微鏡下能清晰的觀察其組織結構，稱之為光鏡標本的基本制作方法或稱為組織制片技術。 

目的生物學標本在生活狀態下多為無色透明，而且組織一旦離開機體后很快就會死亡，其結構就會失去正常狀態。必須對組織采取固定、切片和染色措施！ 

根據所使用支持物質的不同，切片方法分為：

組織切片的主要程序： 

取材、固定→脫水→透明、浸透→包埋、切片→貼片、染色→浸洗→脫水→透明→封固。 

來源：臨床活體檢查，手術切除，病理解剖，實驗動物等 

要求：

1、根據實驗目的和要求及病變程度合理取得組織材料。

2、取材的過程迅速、準確 

組織取材注意事項

固定的目的： 

1）防止標本的自溶與腐敗，以保持組織細胞的固有形態。 

2）使組織細胞內的蛋白質、脂肪、糖和酶等各種物質成份沉淀或凝固成不溶性物質，以保持它原有的結構與生活時相仿。 

3）可增強染色的作用。使組織中的各種物質沉淀凝固而產生不同的折射率，造成光學上的差異，以便染色后易于鑒別和觀察。 

4）固定劑兼有硬化作用，使組織硬化，增加組織硬度，便于制片。 

5）防止細胞過度收縮或膨脹而失去其原有形態結構。另外，對某些具有傳染性的標本，能防止疾病的擴散。

固定的方法： 

物理方法

干燥：血涂片

高熱：細菌涂片

低溫驟冷

化學方法

使用化學試劑配制成固定液固定 

影響固定的因素：

1 .組織固定必須新鮮：無論取人體或動物組織，都必須立即投入固定劑。

2.防止組織因固定劑的作用而發生變形。

3.標本大小：在保證形態結構完整性的同時，厚度不超過5mm。

4.固定液的量：一般為組織塊體積的20-30倍（不得少于標本體積的5倍）。

5.固定時間：根據組織的種類、大小，固定劑種類、性質、滲透力的強弱而定。

6.固定溫度：室溫（20-25℃）或低溫（如4℃），一般不應超過40-45 ℃。

7.選擇適當的固定液

8.促使固定 

注意事項：

免疫組化固定方法的原則是：在保持細胞形態完好和所測抗原的前提下，應選用濃度最低的固定液和最短的固定時間。為此，固定組織時應該： 

1）組織新鮮，盡早、盡快固定。

2）組織塊盡量小。

3）固定后充分水洗，減少固定液造成的人工假象。

 4）針對抗原、染色法選擇最佳的固定方法 。 

常用的固定劑： 

1）10%福爾馬林緩沖液（pH7.4）

2）4%多聚甲醛磷酸緩沖液（pH7.4）

3）Bouin液

4）Zamboni’s液 

5）丙酮 

6）95%乙醇 

?7）A-F液

定義：

利用某種化學試劑逐步將標本內部吸收的水分置換出來，以使標本處于無水狀態，這一過程叫脫水。

目的和原則

1有利于標本的下一步處理，即透明、浸透、包埋

?2有利于切片的操作

3有利于標本的長久保存 

常用的脫水劑：

1.單純脫水劑：如乙醇、丙酮和甲醇

2.脫水兼透明劑：如正丁醇、叔丁醇等

注意事項：

脫水時必須由低濃度脫水劑開始，逐步轉入高濃度脫水劑，經過各級濃度的脫水劑使其所含的水分逐漸減少而代之以脫水劑。防止組織過度收縮變形，或脫水不完全而影響制片效果。

1）組織取材3mm厚度，固定于福爾馬林數小時后再換以新鮮福爾馬林固定數小時。

2）組織流水沖洗6-12h。 

3）70％酒精2-4h。

4）80％酒精2-4h。

5）90％酒精2-4h。

6）95％酒精（Ⅰ、Ⅱ）2-4h。

7）100％酒精（Ⅰ、Ⅱ ）1-2h。

8）二甲苯（Ⅰ）5-30min。

9）(二甲苯（Ⅱ） 5-30min)。

10）浸蠟（Ⅰ、Ⅱ ）2h。

11）組織包埋 

石蠟切片法

優點:

缺點：

冰凍切片法

優點：

缺點：

染色的目的：將標本切片浸于染色劑內，經一定的時間，使組織或細胞及其他的成分被染上不同的顏色，產生不同的折射率，便于在光鏡下進行觀察。 

普通染色：最廣泛應用的是蘇木精和伊紅染色，又稱常規染色。

特殊染色：為顯示特定的組織結構或其他的特殊成分。

復染色：襯托主染色所進行的染色。

常用的染色方法 

一）蘇木精（素）：是現今最常用、最有價值的常規細胞核染色劑，習慣上稱蘇木精是堿性染料 

二）伊紅：是一種胞漿較理想的染色劑。常用伊紅Y。酸性染料組織成分呈彌漫性染色。

1） 脫蠟至水 

①二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各5-10min②100%乙醇 （5～10）min×2或3次③依次95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇各5～10min④蒸餾水浸洗 2～5min

2）蘇木精染色

① 蘇木精1-10min。② 自來水流水沖洗。③ 0.5%鹽酸-乙醇分色，數秒-數十秒。自來水快洗。 

④ 0.5%氨水藍化，30sec-1min，自來水沖洗⑤ 光鏡下鏡檢細胞核分色程度。⑥ 自來水流水沖洗3min。 

3）伊紅染色 

① 1%伊紅1-10min。② 蒸餾水快洗。 

脫水、透明和封固

① 70%、80%、90%乙醇速洗，每級數秒-數十秒。② 95%30sec-1min.光鏡下監控細胞核與細胞質顏色對比。 ③ 100%乙醇，3-5min，2次。④ 二甲苯Ⅰ、Ⅱ,各5-10min。⑤ 封片:中性樹膠

組織化學（histochemistry)或細胞化學（cytochemistry）：是基于已知的化學反應，在組織或細胞原位上顯示出組織或細胞中的化學物質，并研究其化學性質及功能關系的一門技術。是在形態學的基礎上，研究組織或細胞中化學物質的形態、化學成分及定位、定量和代謝狀態的學科。

組織化學的特征：應用物理的和化學的方法來查明細胞或組織的化學成分； 用組織學、化學、物理學原理，研究細胞或組織的結構、功能與化學的關系； 對細胞或組織成分的定位、定性、定量的特征進行研究，來認識細胞或組織結構與功能的關系。具有較強的特異性。 

為了能在完好的結構上同時顯示其化學物質，組織化學技術必須做到：

（1）保存組織（細胞）在生活狀態下的結構；

（2）保存組織（細胞）內的生前化學成分、酶活性及檢測目的物；

（3）所使用的染色方法是按照已知的化學或物理反應原理進行。

（4）反應產物應在組織結構上形成穩定的有色沉淀物質。

（5）檢測手段要有高度的敏感性、特異性和可重復性。

（6）生成物的反應產物必須在原位沉淀，保證定位的精確性及穩定性。

組織（細胞）化學基本步驟冰凍切片或石蠟切片等常規處理后，再進行組織（細胞）化學染色，在光鏡下觀察。 

純化學方法：Schiff反應法、偶氮偶聯法、金屬沉淀法、聯苯胺反應、四唑鹽反應 

類化學方法：屬某些特殊染色技術，如：Best洋紅染色 顯示糖原，Baker酸性蘇木精染色 顯示磷脂，Mayer黏洋紅與黏蘇木素 顯示黏蛋白 

物理學方法：1）脂溶染色法2）熒光分析3）放射自顯影 物理化學方法等

糖類物質的顯示方法： 

PAS顯示法（Periodic Acid Schiff） 阿利新藍法（Alcian Blue） 阿利新藍-PAS復合法（Alcian Blue-PAS） 胭脂卡紅法（Carmine method） 甲苯胺藍法 硫堇法等。

蛋白質顯示方法：

1、pH4.2以下的酸性溶液中，用堅牢綠、溴酚藍、麗春紅-2R等酸性染料染色，出現陽性結果表明有蛋白質存在

2、在pH8.0以上的堿性溶液中，用酸性染料染色，呈陽性結果表明含堿性蛋白質

3、若第2步為陰性結果，則改在酸性溶液中用堿性染料（亞甲基藍）染色。

核酸顯示：1、顯示DNA ： Feulgen法試劑：Schiff試劑、鹽酸、亞硫酸氫鈉 2、核仁組成區和酸性粘多糖復合顯示法：試劑：2%的甲酸、2%的明膠、50%的硝酸銀、阿申藍（8GX）、醋酸溶液3、粘多糖和核仁組成區雙染法試劑：Schiff氏試劑、膠性銀液 4、RNA和DNA的甲綠-派若寧顯示法試劑：甲綠、派若寧。 

酶組織（細胞）化學：用組織（細胞）化學方法顯示酶在組織或細胞內的定位的技術。

常用的方法：酸性磷酸酶  堿性磷酸酶  三磷酸腺苷酶  乙酰膽堿酯酶  細胞色素氧化酶 一氧化氮合酶

影響酶活性的因素： 

1 、溫度：大部分酶反應的合適溫度為37℃。

2、 pH： 酶有適合酶反應速度的pH(大部分為7.0) 

3、抑制劑 能使酶活性降低的物質

4、激活劑 能使酶活性增高的化學物質

5、底物濃度對酶反應速度的影響