今年1月10日，施一公教授團隊在另一頂級學術期刊《科學》（Science）發表了該領域的又一重要研究成果，拉開了2019年我國生命科學領域研究的序幕。

近年來，施一公教授及其所帶領的團隊一直將揭示阿爾茲海默癥的發病機理作為重點研究方向，經過長期不懈的努力，取得一系列重要突破。研讀間第一時間聯系了兩篇論文的共同第一作者，生命學院博士后、結構生物學高精尖創新中心卓越學者楊光輝，為我們講述了研究過程背后鮮為人知的故事。

「雙殺」：連發兩篇頂級期刊

2018年12月31日和2019年1月10日，清華大學施一公教授研究團隊分別于頂級學術期刊《自然》（Nature）和《科學》（Science）發表兩篇與阿爾茲海默癥關鍵蛋白作用機制相關的研究成果，《人源γ-分泌酶識別底物Notch的結構機制》（Structural Basis of Notch Recognition by Human γ-secretase）和《人源γ-分泌酶底物淀粉樣前體蛋白的識別》（Recognition of Amyloid Precursor Protein by Human γ-secretase）的文章，完成了跨年「雙殺」。兩篇文章報道了人體γ-分泌酶結合底物Notch以及和淀粉樣前體蛋白（APP）的高分辨率冷凍電鏡結構，從分子層面為理解γ-分泌酶特異性識別和底物切割的機制提供了重要認知基礎，為研究與阿爾茲海默癥以及癌癥相關的發病機制、特異性藥物設計提供了重要的結構信息。

突破：提供「狙擊式」潛在治療方案

阿爾茲海默癥（Alzheimer’s Disease, AD）是當今世界面臨的最為嚴峻的神經退行性疾病。主要臨床表現為腦組織切片中出現淀粉樣斑塊、神經元死亡、認知和記憶能力受損，最終腦功能嚴重受損直至死亡。統計結果表明，在65歲以上人群中，其發病率高達10%，在85歲以上人群中，發病率更是達到30-50%；我國目前患該病的人口高達500萬，約占世界患者總數的四分之一，并且由于世界范圍內預防治療手段不足、缺乏特效藥物，該疾病有發病年齡提前、發病人數增加的趨勢，給病人及家屬造成極大痛苦，也同時為社會帶來沉重負擔。

阿爾茲海默癥的發病機理尚不明確。病人腦組織中的淀粉樣斑塊，是由淀粉樣蛋白前體蛋白（APP）被酶切割產生的短肽聚集而來。除了淀粉樣蛋白，重要的信號蛋白Notch也是γ-分泌酶的底物。Notch的異常切割會導致發育的異常，與一些諸如T細胞急性淋巴細胞白血病在內的癌癥發病也有重要聯系。

「如果把底物Notch或者APP比喻成一根繩子，那么γ-分泌酶的作用就是要把這根繩子剪成一段一段。如果切割產生異常，或者這些剪出來的小段纏繞在一起就有可能導致疾病。」此外，「作為與阿爾茲海默癥和癌癥均緊密相關的蛋白，很多藥物的研發直接以γ-分泌酶作為靶點，希望通過調節其活性來治療相關疾病。」

近年來，多種旨在減少淀粉樣沉淀的γ-分泌酶活性抑制劑的臨床實驗均宣告失敗，較為著名的是禮來公司臨床實驗的Semagacestat。這一抑制劑雖然能夠減少淀粉樣沉淀，但并不能改善患者的認知狀況，更嚴重的是由于同時抑制了γ-分泌酶對Notch的切割，導致患者罹患癌癥的風險大幅增加，最終該臨床實驗提前終止，而對γ-分泌酶結合底物機制研究的缺失是造成這一失敗的原因之一。基于此，獲得γ-分泌酶與底物Notch以及APP復合物的結構，對研究γ-分泌酶的底物識別酶切機理和以γ-分泌酶為靶標的特異性藥物設計具有極大科學意義和潛在應用價值。

研究團隊認為，這或許為開發底物特異性的抑制劑帶來啟發。類似于從「霰彈槍」到「狙擊槍」的過度，未來可以開發特異地抑制β淀粉樣前體蛋白APP的加工而不影響Notch加工的藥物，靶向治療阿爾茲海默癥且不導致副作用。與此同時，這兩篇文章通過細節方法的創新，首次揭示了膜內蛋白水解酶與底物復合體這一大類的結構信息。

科研：挑戰與驚喜并存

研讀間第一時間聯系了兩篇論文的共同第一作者，生命學院博士后、結構生物學高精尖創新中心卓越學者楊光輝，為我們講述了研究過程背后鮮為人知的故事。

Q1：在研究過程中有什么曲折的經歷？

有的。課題難度很大，最難的點在于獲得穩定的酶和底物的復合體，這一狀態很難捕捉。我們前期在蛋白質設計上做了很多工作，直到最后采用了文章里描述的交聯的辦法。

Q2：研究過程中有什么印象特別深刻的事嗎？

印象深刻的事很多。施老師實驗室一直在做γ分泌酶相關的工作，我自己也一直在思考如何解析γ分泌酶與底物結合的結構。很早就在思考，但是初期各種蛋白質設計的方法并不能獲得酶和底物穩定在一起的狀態。

在讀文獻的過程中看到了酶與底物可能發生相互作用的部分位點，有了一些線索。從2017年初想到并開始嘗試使用交聯的方法，然而也不知道哪幾個氨基酸位點能交聯在一起，于是就在有限的線索下進行嘗試，希望能夠篩選出最優解。我們最終成功獲得了這個解答，并且獲得了Notch與γ分泌酶在一起的狀態，這時已經快到春節了。

我們立即收了一些數據，春節在家遠程計算，大年初三早上我算出來一個初步結果，發現我們想要的底物確實存在。很興奮！有一種迫不及待想把課題做出來的心情。于是我們很快回到實驗室，準備樣品，收集數據，最終把課題做了出來。

還有一個印象深刻的事情就是課題做出來后，我們從結構里發現了一個沒有想象到的二級結構β-sheet的形成。如果沒有結構生物學，是很難想象或者預測出來的。這也是結構生物學巨大的魅力。

Q3：如何在這么短的時間內連續在頂刊發表兩篇論文？

APP和Notch對研究阿爾茲海默綜合癥的發病機理和治療手段都很重要。很多藥物公司投入巨資研發減少APP切割的藥物，其中禮來公司的Semegacestat就是一種γ-分泌酶的抑制劑，這一款被寄予厚望的藥物臨床實驗中確實減少了淀粉樣蛋白的量，但是也增加了病人患癌的風險，原因就是藥物抑制了Notch的切割。所以設計出特異性的只針對性抑制APP切割的藥物非常重要，我們對這方面很感興趣。基于此，要想更全面的解決特異性的問題，我們需要獲得γ-分泌酶分別結合APP和Notch的結構。

其實兩種底物的研究過程是螺旋上升的，一直同時進行。在最初的對APP的嘗試中，由于APP蛋白本身的性質，我們并沒有獲得很大突破。隨后我們比較了Notch與APP的蛋白質序列，驚奇的發現盡管二者序列各不相同，但是二級結構相似性很大。這一規律的總結帶給我們突破口。我們先獲得了Notch與γ-分泌酶的穩定復合物，隨后在解析結構后再次對比APP與Notch的序列，確定了針對APP的方案，真是有一種柳暗花明的感覺。

此外，楊光輝就研究生科研也提出了一些自己的心得和建議。他認為做研究的目的是解釋這個領域的重要的科學問題。同時他認為，要想更好地做研究，這個領域的文章一定要多讀，重要的文章細讀，從中多總結；同時要有批判性思維，對重要的線索要先驗證，再與自己的課題相結合。在實驗過程中一定要注意細節的把握，做好對照實驗，要注重實驗設計的邏輯。

十年求索：愈加清晰的研究視野

施一公教授2006年在清華大學建設實驗室之初，就將揭示阿爾茲海默癥的發病機理作為重點研究方向。此次發表的兩篇研究成果是研究團隊長期以來在該領域持續發力的重要結晶。在此之前，施一公教授及其所帶領的團隊在該領域不斷突破，發表了一系列重要研究成果：

2012年12月，施一公研究組在《自然》（Nature）報道PS1細菌同源蛋白PSH的晶體結構，并根據同源性首次構建了PS1的結構模型，揭示了PS1的結構折疊，并在結構上初步分析了在阿爾茲海默癥病人中發現的PS1突變位點。

2014年6月，施一公研究組與英國MRC分子生物學實驗室白曉晨博士等合作在《自然》（Nature）報道了分辨率為4.5埃的γ-分泌酶復合物電鏡結構，觀察到了其跨膜區域呈馬蹄形排布的結構。

2014年9月，施一公研究組在《美國科學院院刊》（PNAS）發表文章，報道了其中一個亞基Nicastrin同源蛋白胞外結構域的高分辨率晶體結構，推測了Nicastrin在底物招募過程中可能的機制，并且根據同源性構建了人源Nicastrin 胞外結構域的結構，結合該結構與此前解析的PSH晶體結構和4.5埃分辨率電鏡結構，他們在γ-分泌酶跨膜區辨認出了PS1，并進一步推測了該復合物近20個跨膜螺旋的組裝模式。

2015年3月，施一公研究組在《美國科學院院刊》（PNAS）發表論文，報道PS1的細菌同源蛋白PSH具有與γ-分泌酶類似的底物切割活性，并且其酶活也受到γ-分泌酶小分子抑制劑的抑制，并解析了該抑制劑與PSH的復合物結構，揭示了其抑制位點，從而使得PSH可以作為一個研究成本相對低廉的替代品來進行γ-分泌酶調控小分子的初步篩選。

2015年4月，施一公研究組在《美國科學院院刊》（PNAS）發表論文，報道人源γ-分泌酶4.3埃的冷凍電鏡三維結構。與一年之前的4.5埃結構相比，盡管分辨率只提高0.2埃，但是跨膜區密度質量有了極大提高。此外他們在PS1的N端連接T4-溶菌酶蛋白，從而準確定位出PS1的第一個跨膜螺旋，并在此基礎上判斷出四個亞基，驗證了在2014年PNAS文章中推測的組裝方式。此外，他們利用性質非常緩和的去污劑制備樣品，證明電鏡觀察到的結構并未因蛋白純化和冷凍制備而受到影響。這個結構也是清華大學電鏡平臺的K2電子探測相機自2014年暑期正常運轉之后解析出的最小分子量的結構。

2015年8月18日，施一公研究組在《自然》（Nature）在線發表了題為《人源γ-分泌酶的原子分辨率結構》（An Atomic Structure of Human γ-secretase）的文章，報道了分辨率高達3.4埃的人體γ-分泌酶的電鏡結構，并且基于結構分析研究了γ-分泌酶致病突變體的功能，為理解γ-分泌酶的工作機制以及阿爾茲海默癥的發病機理提供了重要基礎。

2017年，施一公研究組于《美國科學院院刊》（PNAS）發表兩篇文章，對γ-分泌酶上疾病相關突變切割APP的性質和機理進行了研究。