什么是微型化雙光子熒光顯微鏡？

　　成像技術是推動生命科學進步的核心動力。上世紀以來，人類陸續發現了包括X射線、全息照相法、CT、電子顯微鏡、MRI磁共振成像、超高分辨率顯微成像在內的多種成像技術。

　　而近年來，生命科學研究的發展趨勢從分子與細胞的層級上升到離體組織與器官、歷經在體麻醉動物細胞顯微到現在的清醒動物的分子與細胞動態信號，不斷對成像技術提出新的要求，即在清醒活體的狀態下還要保證分子水平的分辨率。

　　主導本次研發過程的程和平院士團隊認為，雙光子顯微成像會是解決這個挑戰的一個重要方面。

　　程和平院士

　　據程院士介紹，雙光子顯微鏡其實不是新鮮事物，1930年代，M·Goeppert Mayer就提出了雙光子吸收躍遷的基本原理；1960年代，激光器的發明使得雙光子效應被驗證和應用；1990年，Denk，Webb發明了第一臺雙光子顯微鏡，至今已有20多年的歷史。

　　如今，雙光子熒光顯微鏡是活體動物神經成像的經典方法。雙光子成像本身具有高分辨率、高通量(高速)、非侵入、成像深度大等特點，與熒光蛋白以及熒光染料等標記物在細胞中的定位與表達技術相結合，能夠在生命體和細胞仍具有活性的狀態下對其功能進行動態觀察，使得人們可以研究處于生理狀態時的動物大腦內的神經元活動。

　　雙光子成像技術面臨的挑戰

　　程院士認為，盡管雙光子成像有看得準、看得深、光損傷小等優點，但也存在看活體不準、掃描速度慢、體積龐大無法便攜化等缺點。

　　之前在神經科學領域，如果科學家想要對小動物在行為過程中的大腦活動進行成像研究，是采用了一種看起來非常好玩而又黑科技的方式。

　　將虛擬現實與雙光子成像相結合，在小動物頭部被固定的情況下，在其眼前制造影像，讓動物認為自己處在“真實”的環境之中，通過動物四肢在類似跑步機或者鼠標滾球上的運動來模擬其真實活動，以求達到研究神經元在動物行為中所起到的作用。

　　但是，這種虛擬現實加頭部固定成像的方法，已經遭到許多科學家的質疑。他們認為，頭部被固定會使動物在實驗期間受到物理約束和情緒的壓力，因此無法證明虛擬現實下得到的結果等同于真實環境。

　　更重要的是，許多社會行為，比如親子護理，交配和戰斗，是不能用頭部固定的方式進行研究的。如何在動物自由活動的時候，直接對其神經元進行成像，是神經科學家還未能得到解決終極的訴求。

　　所以，開發一種微型熒光顯微鏡，讓其直接固定在自由活動的動物身上成為了解決問題的關鍵。十多年來，人們經歷了微型單光子寬場顯微鏡；重達25克、且成像速度慢的雙光子顯微鏡等階段，一直無法攻克微型雙光子顯微鏡需要解決的諸多技術難題。

　　新一代微型化雙光子熒光顯微鏡的性能

　　在這樣的背景下，北京大學聯合解放軍軍事醫學科學院組成了跨學科團隊，歷經三年時間，成功研制出新一代高速高分辨微型化雙光子熒光顯微鏡，并獲取了小鼠在自由行為過程中大腦神經元和神經突觸活動清晰、穩定的圖像。原始論文于5月29日在線發表于自然雜志子刊 Nature Methods 上。

　　據悉，新一代微型化雙光子熒光顯微鏡重量僅2.2克，橫向分辨率可達到0.65微米，成像質量與商品化大型臺式雙光子熒光顯微鏡可相媲美。采用雙軸對稱高速微機電系統轉鏡掃描技術，成像幀頻已達40HZ（256*256像素），同時具備多區域隨機掃描和每秒1萬線的線掃描能力。

　　此外，采用自主設計可傳導920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統首次實現了微型雙光子顯微鏡對腦科學領域最廣泛應用的指示神經元活動的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用。同時采用柔性光纖束進行熒光信號的接收，解決了動物的活動和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來，與光遺傳學技術的結合，有望在結構與功能成像的同時，精準地操控神經元和神經回路的活動。

　　研究意義和價值

　　微型化雙光子熒光顯微成像改變了在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結構的方式，可用于在動物覓食、哺乳、跳臺、打斗、嬉戲、睡眠等自然行為條件下，或者在學習前、學習中和學習后，長時程觀察神經突觸、神經元、神經網絡、遠程連接的腦區等多尺度、多層次動態變化。

　　該成果在2016年底美國神經科學年會、2017年5月冷泉港亞洲腦科學專題會議上報告后，得到包括多位諾貝爾獎獲得者在內的國內外神經科學家的高度贊譽。

　　冷泉港亞洲腦科學專題會議主席、美國著名神經科學家加州大學洛杉磯分校的Alcino J Silva教授在評述中寫道

　　從任何一個標準來看，這款顯微鏡都代表了一項重大技術發明，必將改變我們在自由活動動物中觀察細胞和亞細胞結構的方式。它所開啟的大門，甚至超越了神經元和樹突成像。系統神經生物學正在進入一個新的時代，即通過對細胞群體中可辨識的細胞和亞細胞結構的復雜生物學事件進行成像觀測，從而更加深刻地理解進化所造就的大腦環路實現復雜行為的核心工程學原理。毫無疑問，這項非凡的發明讓我們向著這一目標邁進了一步。

　　目前腦科學的發展如火如荼，各國腦科學計劃的一個核心方向就是打造用于全景式解析腦連接圖譜和功能動態圖譜的研究工具。其中，如何打破尺度壁壘，整合微觀神經元和神經突觸活動與大腦整體的活動和個體行為信息，是領域內亟待解決的一個關鍵挑戰。

　　該設備的成功問世對于腦科學的研究有重大意義，人類探索大腦星辰大海的征程又進入一個嶄新的階段。

　　程和平院士團隊接受采訪

研究團隊接受采訪

　　主題演講結束后，程和平院士團隊接受了雷鋒網等媒體的采訪，以下是采訪實錄，雷鋒網做了不改變原意的整理：

　　1、提到腦科學，不得不讓人聯想到現在很火熱的人工智能。請問目前你們團隊所取得的成績可以和人工智能的哪方面研究做對接？

　　程院士團隊：目前的人工智能還處于弱人工智能階段，要想實現強人工智能，還是要像生物腦進行學習。最簡單的一個模式生物，學會一件事情或者說一個條件學習的過程，只需要半個小時或一個小時就能形成。

　　在這個過程中神經的回路正在發生了什么變化，原來是沒辦法知道的，但是用了我們這些微型化的鏡子，就可以在它們執行某個動作的學習的過程中看到各個回路不同層次的特性變化。

　　2、現在的顯微鏡技術和你們新研究出來的技術有何區別？新研究的先進性體現在哪里？

　　程院士團隊：我們的競爭對手是Mark Schnitzer教授，他是美國腦計劃的發起人，所以我們剛開始也是征詢了他們的意見的。我們和他們最大的不同是在同樣重量的情況下，我們的分辨率更高、而且看的更深。

　　3、這個研究成果在人類大腦的應用前景如何？

　　程院士團隊：比如，在外科手術的臨床應用上，因為我們可以提供手持式的技術，當需要做開顱手術的時候，就可以看到腫瘤的邊界和大腦的神經活動。

　　4、這項研究的商業化進展如何？

　　程院士團隊：目前已經有兩個諾貝爾獎獲得者對我們的研究感興趣，想一起合作。說明這個技術還是很受歡迎的。就像剛才說的，一方面能夠將技術封裝為手持式或內窺的醫用設備，一方面神經科學家需要的那種顯微鏡，一只研究的小鼠頭上就要帶一臺，如果是猴子的話可能要帶幾臺，所以我們認為市場還是非常大的。