Stefan Hell打破了物理學界的傳統看法
自從1873年Ernst Abbe第一次發現光學成像具有衍射限制現象以來，物理學界就公認，顯微鏡的分辨率具有極限，該極限與光源的波長有關。直到一個多世紀之后，羅馬尼亞物理學家Stefan Hell推翻了這一觀點。他是首位不僅從理論上論證了，而且用實驗證明了使用光學顯微鏡能達到納米級分辨率的科學家。
羅馬尼亞物理學家Stefan Hell，現任德國馬克斯·普朗克生物物理化學研究院(Max Planck Institute of Biophysical Chemistry)主任。
早在上世紀80年代中期，當時師從德國海德堡大學(University of Heidelberg)一位低溫固態物理學家的Stefan Hell就已經發現，如果不是像常規那樣使用一個透鏡聚焦，而是將兩個大孔徑的透鏡組合在一起聚焦，就可以提高光學顯微鏡的分辨率。Stefan Hell是首位發現這一現象的研究人員。
Hell于1990年順利完成了他的博士學業，但同時，這也意味著他將無法再憑借獎學金的資助進行研究了。Hell最終決定獨自一人繼續在家研究以上的發現，并最終成功發明了4Pi顯微鏡。
4Pi顯微鏡，超高分辨率成像中的一個步驟
時任美國馬薩諸塞州坎布里奇市哈佛大學(Harvard University)化學系教授的Sunney Xie遇到了Hell，當他了解了Hell發明的4Pi高分辨率顯微鏡時，Xie對Hell勇敢地對傳統物理學觀點提出挑戰的精神表示贊許。
隨后，Hell帶著他的發明來到了位于德國海德堡的歐洲分子生物學實驗室(European Molecular Biology Laboratory, EMBL)，并獲得了德國科學基金會提供的獎學金。1991年，Hell在該實驗室開始他的博士后研究工作。
起初，許多科學家，包括那些聲名顯赫的物理學家都認為Hell的工作對于提高光學顯微鏡的分辨率沒有太大的意義。他們認為，Hell僅用他那少得可憐的科研經費來從事這項研究簡直就是在冒險。但Hell卻始終堅信他能夠打破衍射極限。
Hell的努力沒有白費，他的冒險終于獲得了回報。1992年，Hell第一次用他的4Pi高分辨率顯微鏡證明了他的確能將傳統光學顯微鏡的分辨率提高3~7倍。然而，盡管Hell提高了Z方向的分辨率，他還是沒能突破衍射極限的限制。
此后不久，Hell又在芬蘭土爾庫大學(University of Turku)得到了他的第二個博士后職位。一個星期六的早晨，Hell正躺在研究生公寓的床上看一本有關光學量子理論的書，突然，靈光一閃，Hell腦海里浮現了一個想法：如果使用一種合適的激光，僅激發一個點的熒光基團使其發光，然后再用一個面包圈樣的光源抑制那個點周圍的熒光強度，這樣就只有一個點發光并被觀察到了。Hell給他的這項發明取名STED，即受激發射損耗顯微鏡(stimulated emission depletion)。有了這個想法后，Hell立即行動，沖進實驗室進行相關實驗。每當回想起當時的心情，Hell都會覺得那是他科研生涯中最激動的時刻。
曾在EMBL與Hell共事，并共同研發4Pi顯微鏡的Pekka Hanninen指出，Hell在土爾庫大學進行研究工作時非常刻苦。那時，他經常被許多問題困擾。盡管如此，研究過程中還是有許多快樂縈繞著他們。Hell不僅是一名嚴謹的科學研究者，還是一名音樂愛好者，每當工作至深夜時，實驗室走廊總會回響起Hell吹奏薩克斯風的動聽樂聲。
由共聚焦顯微鏡(左圖)和STED(右圖)成像的一個神經元。
1994年，Hell在《光學快報》(Optics Letters)上發表了他關于STED的理論文章。不過直到多年以后，這項理論才得以在實踐中被證實。在那段時間里，Hell一面繼續研究工作，一面四處奔走籌集科研經費，還賣掉了他4Pi 顯微鏡的專利。
但是那個時候Abbe的衍射極限理論仍然在學界占統治地位，許多物理學家對Hell的理論都持懷疑甚至批評態度，因此他們也都將研究重點放在其它的成像技術上。盡管如此，Hell還是在1997年與馬普生物物理化學研究所簽訂了一份長達5年的合同，以繼續他的STED研究。
1999年，Hell將他的研究成果分別投給了《自然》(Nature)雜志和《科學》(Science)雜志，不過都被退稿。當時兩位雜志的主編都沒有意識到他的研究成果將會改變整個顯微鏡領域。
直到2000年，事情才終于有了轉機——《美國國家科學院院刊》(PNAS)發表了Hell的科研成果。采用 Hell的STED技術，人們第一次得到了納米級的熒光圖像。Hell的工作由此獲得了廣泛的肯定，2002年，他獲得了馬普研究所的終身職位。從此，Hell一直在馬普研究所從事成像技術的研究工作。
緊隨STED這項開創性工作之后，世界各地實驗室等研究機構內陸續出現了一批高分辨率的顯微鏡技術。例如，由珍妮莉婭法姆研究學院(Janelia Farm Research Campus)的物理學家兼工程師Mats Gustafsson領導的研究團隊開發出了結構光學顯微鏡(structured-illumination microscopy, SIM)。
果蠅卵母細胞內的肌動蛋白的3D SIM成像，該照片拍攝于完整的卵泡內。
SIM技術的原理是通過一系列光成像的圖案對低分辨率莫爾條紋形式的精細結構進行成像，此類圖像是采用其它技術所無法觀察到的。然后再由計算機處理、分析這些條紋中包含的信息，最終就可以獲得高分辨率的圖像。
同年，Gustafsson小組得到了HeLa細胞中肌動蛋白細胞骨架的圖像，他的圖像相比傳統顯微鏡的圖像來說，在測向上的分辨率提高了2倍。隨后，Gustafsson小組又使用非線性技術將整體分辨率提高了4倍。
科研競賽
2006年，超高分辨率顯微鏡研究行業翻開了新的篇章。Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小組、Samuel Hess小組以及莊曉威(音譯)科研小組幾乎同時報道了他們提高顯微鏡分辨率的科研成果，下面分別介紹這三個小組的研究情況。
Eric Betzig、Harald Hess以及Jennifer Lippincott-Schwartz小組
2005年夏天，細胞生物學家Jennifer Lippincott-Schwartz卸下了她在美國馬里蘭州貝塞斯達美國國立衛生研究院(HIV)暗室里的紅色燈泡。Lippincott-Schwartz正在為賦閑在家的兩位物理學家Eric Betzig和Harald Hess騰出空間，籌備實驗室。正是這兩位物理學家研制出了光敏定位顯微鏡(photoactivated localization microscopy, PALM)，他們的這種新產品能將熒光顯微鏡的分辨率提升至納米級水平。
接下來的整個冬天，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz等人都一直在那間狹小的沒有取暖設備的實驗室里工作。現在就職于美國弗吉尼亞州阿士伯恩霍華德休斯醫學研究所珍妮莉婭法姆研究學院(Howard Hughes Medical Institute’s Janelia Farm Research Campus in Ashburn, Virginia)的Hess承認，自己與Betzig對生物學的認識都不深。不過近15年來，他們一直都在努力，希望能運用生物學知識獲取高分辨率的顯微圖像，但是沒有取得明顯進展。然而，當Hess和Betzig了解到Lippincott-Schwartz和George Patterson在2002年發明的光敏綠色熒光蛋白(photoactivatable green fluorescent protein)后，他們知道他們已經找到了解決問題的關鍵所在。
回想起當時的情形，Lippincott-Schwartz指出：“他們當時非常激動。我還記得當我們得到第一張顯微圖像時，你根本無法看出那是什么東西。直到我看到他們將熒光圖像和電鏡圖像疊加之后的結果才相信，我們成功了。我當時覺得這一切真是太神奇了。”
2006年，Eric Betzig、Harald Hess以及Lippincott-Schwartz小組在《科學》(science)雜志上發表了他們的PALM研究成果。使用PALM可以清楚得看到細胞黏著斑和特定細胞器內的蛋白質。
Samuel Hess小組
Samuel Hess小組是上述三個小組之一。Hess是美國緬因州立大學(University of Maine)物理系的助理教授。2005年夏天，Hess一直在和他們學校的化學工程師和生物學工程師，就如何提高觀察活體細胞脂筏結構的分辨率等問題進行交流。
2005年的一個夏夜，Hess被鄰居家舉辦舞會的聲音吵醒。半睡半醒的Hess走下樓來，隨手畫了一副設計圖，他的這種設計是需要借助熒光標記的蛋白質來顯示細胞形態的。第二天早上，當Hess重新翻看這幅非清醒狀態繪制的潦草的設計圖時，不由得大笑起來。不過令人吃驚的是，他的這幅設計圖竟然沒有一點問題。于是他把這幅圖拿給物理系的同事檢查，但同事也沒有發現任何問題。
接下來，Hess就按照他的設計圖開始制作顯微鏡了。此時，他的科研經費所剩不多，而結題時間轉眼就到。因此，Hess等人以最快的速度組裝好顯微鏡，并進行了試驗。同時，在不到兩天的時間里，緬因州立大學表面科學技術實驗室的同事就為Hess制備好供檢驗顯微鏡效果的藍寶石晶體樣品。
對于同事們的幫助，Hess總是不勝感激。
2006年，《生物物理學期刊》(Biophysical Journal)刊登了Hess小組的科研成果。他們將這項研究成果命名為熒光光敏定位顯微鏡(fluorescence photoactivation localization microscopy, FPALM)。2007年，Hess小組證明了FPALM可以分辨細胞膜脂筏上的蛋白質簇。
莊曉威科研小組
與此同時，另一個研究小組——哈佛大學霍華德休斯醫學研究所(Howard Hughes Medical Investigator at Harvard University)的研究員莊曉威科研小組也在研究高分辨率成像技術。
通過3D STORM觀察到的一個哺乳動物細胞內線粒體網狀系統。傳統熒光成像(左圖);3D STORM成像(中圖)，其中，采用不同顏色標記出z的位置;3D STORM成像中xy維圖像(右圖)。
其實，這三個小組都有一個共同的也是非常簡單的理念，那就是先獲得單分子熒光圖像，再將成千上萬個單分子圖像疊加在一起，獲得最終的高分辨率的圖像。
早在2004年初，莊等人就已經意外發現了有一些花青染料可以用作光敏開關。這也就意味著這些染料既可以被激活發出熒光，也可以被關閉不發光，人們可以使用不同顏色的光束來隨意控制這些花青染料的開和關。
從那以后，莊等人就一直在研究如何用光敏開關探針來實現單分子發光技術。他們希望能用光敏開關將原本重疊在一起的幾個分子圖像暫時分開，這樣就能獲得單分子圖像，從而提高分辨率。Eric Betzig小組和Samuel Hess小組也都采用了同樣的策略，只不過他們使用的不是光敏開關而是一種可以先被熒光激活繼而被漂白失活的探針。
2006年，莊的科研成果在《自然-方法》(Nature Methods)雜志上發表，他們將這項成果命名為隨機光學重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。使用STORM可以以20nm的分辨率看到DNA分子和DNA-蛋白質復合體分子。
此后幾年，超高分辨率熒光顯微鏡又得到了進一步的發展。現在，生物學家已經能夠使用超高分辨率熒光顯微鏡在納米水平上觀察細胞內部發生的生化變化了。以往那些大小在200nm至750nm之間的模糊泡狀圖像再也無法對他們造成困擾了。盡管早在上世紀80年代，科研機構里就已經出現了超高分辨率顯微鏡的構思，但只是最近幾年里這項技術才伴隨著它的商業化進程獲得了快速發展。現在，已經有幾十家實驗室安裝了這種最新型的顯微鏡并投入了使用。正像Lippincott-Schwartz所說的，超高分辨率顯微鏡正在以飛快的速度被科研界接受，在生物學界更是如此。
超高分辨率顯微鏡的成績
已經開始使用這些顯微鏡的生物學家對這項技術都表示出了極高的熱情。Jan Liphardt這位在美國勞倫斯伯克力國家實驗室(Lawrence Berkeley National Laboratory)工作的生物學家，還清楚地記得他2006年第一次在《科學》(science)雜志讀到Betzig的那篇有關PALM技術的論文時的激動心情。當他看到那幅線粒體蛋白的圖像時立刻想到了該技術可以用于他自己的微生物研究領域。
Liphard說道：“通常，我們得到的大腸桿菌熒光圖像都只有20像素，甚至更低，現在突然有一幅幾千像素的圖片擺在你面前，你可以想象那是一種什么感覺。”
Liphard現在正與Betzig以及其他一些研究人員一起研究大腸桿菌的趨化現象(chemotaxis)。Liphard還提到：“我從沒想到這項技術達到的分辨率有這么高，可以如此清楚地看到細胞內單個蛋白質分子的定位，甚至還能定量。而對我來說，每天的工作實際上就是在弄清楚這些蛋白質在什么位置，什么時候存在。而之前我們的研究主要采用間接方法。但超高分辨率顯微鏡這項新技術是我從事科研工作這么長時間以來，感觸最深，獲益最大的一項科技成果。”
美國丹佛市科羅拉多州立大學醫學院(Medicine at the University of Colorado Denver)的助理教授Nicholas Barry也正在和Betzig合作，他們使用了一臺蔡司的全內反射熒光成像系統(total internal reflection fluorescence imaging, TIRF)來研究腎細胞頂端胞膜上的蛋白質簇。
Barry指出，只需要一臺蔡司顯微鏡和普通電腦，差不多就足夠了。此外，他們還花費3萬美元添置了兩臺激光發射器。現在，Barry等人可以在8分鐘內得到一幅圖像，這幅圖像由10000幀圖像合成，每一幀圖像上顯示10個分子。最后的圖像文件大小大約是0.3GB。Barry等人還使用Perl語言自己開發了一套免費程序。Barry表示：“這里面包含了每幀圖像的資料信息，客戶可以根據這些信息進行相關計算。”Barry充滿信心地提到，很快就會有人為NIH的那套免費圖像分析軟件ImageJ開發出一套運算程序作為插件使用。
美國斯坦福大學(Stanford University)化學及應用物理系教授W.E. Moerner曾于1989年第一個在試驗中使用光學顯微鏡得到了單分子圖像。W.E. Moerner教授表示，這幾年來，超高分辨率顯微鏡研究領域已經取得了巨大的進展，終于達到了納米級單分子分辨率。他興奮地說：“經過了近20年對單分子成像課題的研究，我們終于取得了完美的成果。”
展望
自從2006年STORM技術和PALM技術問世以來，科技工作者就一直在不斷努力，對它們進行改進、完善和提升。2008年，Lippincott-Schwartz的研究團隊將PALM技術和單顆粒示蹤技術(single-particle tracking)結合，成功地觀測到活體細胞胞膜蛋白的運動情況。同年，莊小威研究組在《科學》(science)雜志上也發表了他們的3D STORM成像成果，該技術的空間分辨率比以往所有光學3D成像技術的分辨率都要高出10倍。論文中，他們展示了用3D STORM成像技術拍攝的腎細胞內微管結構圖和其它的分子結構圖。隨后，他們又進一步將該技術發展成了多色3D成像技術(multicolor 3D imaging)。Gustafsson，還有其他一些科研工作者使用3D SIM技術(該技術使用3束干涉光，而不是常見的2束)觀察到了共聚焦顯微鏡(confocal microscopes)無法觀測到的哺乳動物細胞核內結構。位于德國的世界知名光學儀器制造公司蔡司公司進一步發展了SIM和PALM技術，不過他們將PALM稱為PAL-M。蔡司公司預計將于2009年末推出全新的成像產品。
2008年，Hell小組使用STED技術通過抗體標記目標蛋白，觀察到了活體神經元細胞中突觸小泡(synaptic vesicles)的運動過程。同年稍晚些時候，他們又使用4Pi顯微鏡和STED技術得到了固定細胞內線粒體的3D圖像，分辨率達到了40至50nm。最近，他們又使用超高分辨率顯微鏡成像技術對腦切片組織中的形態學變化進行了研究，并得到了活體神經元細胞樹突棘(dendritic spines)的3D圖像。
PALM在哺乳動物細胞內拍攝到的粘附復合物。
由于最近幾年這些新技術的不斷涌現，現在可以對活體細胞進行三維觀察了。Gustafsson指出，隨著PALM技術和STORM等新技術的出現，以前很多看起來不可能的事情現在都變得可能了。
盡管已有許多科學家從這項技術進展中獲益，但是仍然可以進一步提高，以使更多的研究人員能夠在自己的工作中使用它。到目前為止，那些成功應用此項技術的實驗室都采取了正確的技術組合：研究人員可以很好地將物理學與生物學相結合——他們將顯微鏡裝配并做適當的調節，然后用它對生物學樣品進行檢測。Moerner指出，軟件的編寫也不容小覷：對檢測到的光子進行定位和報告需要進行準確計算，從而得到合適的分辨率。
僅僅是顯微鏡的價格就已經限制了它的普及性，Leica’s TCS STED顯微鏡高達100萬美元。因此，如何獲得相應的資金來購置顯微鏡仍然是擺在研究人員面前的一個難題，位于丹佛市的科羅拉多大學(University of Colorado)光學顯微鏡組主任Bill Betz這樣說道。
Betz曾申請用于顯微鏡購置的資金，但遭到了拒絕。但他表示，他們已經計劃再次申請相關資金。而Stefan Hell曾指出，激光領域的技術進展已經可以使得研究人員自己在實驗室內構建一個STED平臺，花費只需不到10萬美元。
除了要將這一技術方法普及，使生物學家能夠加以利用之外，該項技術的研發人員還表示，他們已經開始致力于研究更寬范圍及更多樣的熒光探針了。更好的探針當然能夠為我們帶來更高的分辨率及更快速的圖像處理。美國紐約阿爾伯特•愛因斯坦醫學院(Albert Einstein College of Medicine)解剖學及結構生物學副教授Vladislav Verkhusha說到：“為了對活體哺乳動物細胞進行研究，你就需要有一整套的熒光標記蛋白和可通過光控開關控制的蛋白質。”他本人在熒光蛋白領域的研究工作就受益于PALM的出現。
莊曉威的眾多項目之一便是與Alice Ting及其在麻省理工學院(MIT)的實驗室合作，對蛋白標記技術進行研究，希望能夠找到一種方法可以將小和明亮的光控開關可控的探針標記于細胞的特異蛋白上，從而可以對活細胞進行成像。她提到：“將遺傳標記方法與小而明亮且可被光控開關控制的探針結合在一起，將是今后發展分子級別超高分辨率成像的十分理想的一種方法。”
盡管研發人員還將繼續努力，以進行相應技術的提高，但是超高分辨率熒光顯微鏡更加廣泛的應用還是毫無疑問地成為新的一年的標志。Harald Hess說：“這一技術的確會為生物學家的工作帶來很大的幫助。同時，我們也在不斷詢問，‘你們想要用它做什么精彩的實驗?’事實上，我們也得到了許多精彩的答案。”
