引言
1971年瑞典的Engvall等人分別以纖維素和聚苯乙烯試管作為固相載體吸附抗原/抗體，建立了酶聯免疫吸附測（Enzyme Linked Immunosrbent Assay,簡稱ELISA），后來人們改用板式反應孔進行ELISA，大大地提高了實驗通量。ELISA實驗具有極高的靈活性，實際操作中人們可以根據自己的需要以及手上已有的材料進行靈活的組合而進行各種可樣的ELISA進行反應測定，另外ELISA實驗中的相關試劑和耗材都已經商品化，所以ELISA被廣泛地應用于生物學的各種研究中。通過ScienceDirect搜索可以看出，1975年只有1篇文獻是研究ELISA的，1976年為6篇，但是到2010年這一數字上升到1994篇，歷年文獻累計達29490篇，足見其研究之廣。ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。
ELISA的種類及原理
關于ELISA的分類眾說紛紜，不同文獻從原理或操作上都有不同的分類意見。這里先將ELISA分為以下四大類，然后針對每一類進行詳細講解：(1)直接ELISA；（2）間接ELISA；（3）夾心ELISA；（4）競爭抑制ELISA。其它的ELISA都隸屬于這四類ELISA或由這四類ELISA組合衍生。
【直接ELISA】
直接ELISA是所有ELISA中步驟最簡單的一種，其方法是將抗原按一定的比例用包被緩沖液稀釋好包被到固相載體上，包被完成后簡單洗滌，再加入封閉液，封閉結束后再次洗滌除去多余封閉液，加入稀釋好的特異性的酶標抗體，37℃溫育一小時或4℃溫育過夜后，洗滌除去多余的抗體，加入底物顯色并判讀結果。最后顯色的深淺與加入的酶標抗體量成正比。直接ELISA的原理如圖1：
圖1直接ELISA原理
一個很常見的直接ELISA實例就是檢測單抗亞型，實際操作中可以將經過親和純化的單抗包被在酶標板上，封閉后加入酶標分型二抗，最后加底物顯色即可。此外用直接ELISA可以檢測血清種屬，也有人用直接ELISA進行單克隆抗體制備中的初步篩選。不過雖然直接ELISA操作很簡單，步驟也比較簡練，但是其應用范圍還是非常有限的，一個重要的原因是這種ELISA中只經過了一步信號放大（酶的放大），所以其靈敏度不是很高，另外其測定的對象也非常有限，只能測定酶標記的分子。
【間接ELISA】
間接ELISA的步驟與直接ELISA步驟前面的部分基本一致，不同的是，間接ELISA中與包被好的抗原結合的不是酶標抗體，而是非酶標的，另外再引入第二種抗體（即二抗），二抗是經過酶標的，它可以與第一種抗體（與抗原直接結合的抗體，即一抗）特異性結合。最后加入底物顯色并判讀結果。當二抗的濃度一定的時候，最終的顯色結果與一抗的量是正相關的。間接ELISA的操作如圖2，同直接ELISA將抗原包被到酶標板上，洗滌后封閉，再次洗滌后加入稀釋好的待檢抗體（一抗），溫育后洗掉未與抗原結合的一抗，再加入酶標二抗，再次溫育，此時酶標二抗即可與一抗結合，最后加入底物顯色。
由于二抗一般為多抗，因此一個一抗分子上可以結合多個二抗分子，同時一個二抗分子上可以標記上多個酶分子，所以當待測抗體為多抗時（可以由多個一抗分子與抗原結合），信號經過兩步放大，最終提高了檢測的靈敏度。另外由于二抗制備比較容易，而且很早就開始商品化，所以操作者無需要將一抗進行酶標，大大縮減了工作量。在檢測抗體的效價、血清的效價以及單克隆抗體的篩選過程中，間接ELISA都是非常重要的實驗過程，在臨床診斷中，間接ELISA也是檢測標志性抗體的重要手段。
圖2間接ELISA原理
【夾心ELISA】
夾心ELISA（Sandwich ELISA）總體上可以分為兩種：直接夾心ELISA和間接夾心ELISA。直接夾心ELISA又分為雙抗夾心ELISA和雙抗原夾心ELISA。雙抗夾心ELISA的方法是：將第一種抗體（捕獲抗體）包被在固相載體上，封閉后加入待檢抗原，溫育后加入第二種抗體（檢測抗體），捕獲抗體和檢測抗體可以是針對不同表位的兩種單抗，也可以是針對同一抗原的一種單抗與一種多抗，但是檢測抗體需要經過酶標。雙抗原夾心ELISA的原理和操作與雙抗夾心基本相同，不同的是包被的是抗原，待檢對象是抗體，然后加入酶標抗原，再加底物顯色。直接夾心ELISA的原理如圖3。
圖3直接夾心ELISA原理
對于雙抗夾心ELISA，待檢對象必須包括兩個或者兩個以上的表位，否則檢測抗體無法與待檢抗原結合，例如半抗原和小分子抗原都是不能用雙抗夾心ELISA檢測的。對于雙抗原夾心ELISA，其操作與間接ELISA基本相同，但利用特異性的抗原代替酶標二抗，所以特異性比間接法更好。另外，由于間接ELISA中使用的二抗一般只能識別IgG，而雙抗原夾心ELISA中任何類似的免疫球蛋白都可以被檢測出，因此雙抗原夾心ELISA比間接ELISA也更靈敏。
下面我將結合一些試劑盒舉例說明加拿大(ANOGEN) human interleukin-8(IL-8),這個指標試劑盒的用到的系統就是這種直接夾心ELISA,在此基礎上發展了親和素(avidin)生物素(biotin)系統(system)，以生物素標記的抗體（或抗原）代替原ELISA系統中的酶標抗體（抗原），加拿大(ANOGEN) human interleukin-1β(IL-1β)，TNF-α，IL-6 均用到此體系。
間接夾心ELISA是基于兩種不同種屬來源的抗體的夾心ELISA，其原理是將一種種屬來源的特異性抗體包被于固相載體上（作為捕獲抗體），封閉，加入待檢抗原，溫育，洗滌后加入另一種種屬來源的特異性抗體（非酶標，作為檢測抗體），最后加入酶標二抗（特異性識別檢測抗體），再加底物顯色。間接夾心ELISA的原理如圖4。與直接雙抗夾心ELISA相比，間接夾心ELISA中引入了特異性識別檢測抗體的酶標二抗，相當于整個體系的信號增加了一步放大系統，于是最終的結果比直接雙抗夾心ELISA更靈敏。同時，由于間接夾心ELISA中的酶標二抗僅能識別檢測抗體，而不能識別捕獲抗體，所以體系的特異性也得到了保障。值得提出的是，間接夾心ELISA并不是嚴格要求捕獲抗體與檢測抗體來源于同一物種，也可以是這種情形：僅用特異性的抗體的Fab片段包被固相載體作為捕獲抗體，而用未經處理的同種屬來源的特異性抗體作為檢測抗體，酶標二抗選用只針對檢測抗體的Fc段的二抗，這樣的酶標二抗同樣不能識別捕獲抗體，從而使這種體系里的捕獲抗體與檢測抗體起到類似于不同種屬來源的效果。間接夾心ELISA涉及的體系比較復雜，用到的試劑也比其它的ELISA復雜，但是其檢測靈敏度上的優越性使它在檢測那些低豐度抗原的樣品中應用得十分廣泛。
圖4間接夾心ELISA
【競爭抑制ELISA】
競爭抑制ELISA又叫封閉ELISA，其主要原理是用待檢抗原或抗體去干擾已經預先設計好的體系，最終顯色的結果與待檢抗原或抗體的干擾程度成負相關。競爭抑制ELISA靈活性很強，可以在此基礎上設計出更復雜的實驗方案，從而派生出所謂的直接競爭抑制ELISA、間接競爭抑制ELISA、夾心競爭ELISA等特殊的ELISA方法。這里僅以直接競爭抑制ELISA和間接競爭抑制ELISA為例簡單闡述原理。直接競爭抑制ELISA中，預先將抗原包被在固相載體上，并加入酶標的特異性抗體。實驗時，加入待檢抗原（或抗體），如果待檢對象是抗原，則待檢抗原就與預先包被在固相載體上的抗原競爭結構酶標抗體；如果待檢測對象是抗體，則待檢抗體就與系統中原有的酶標抗體競爭結合包被在固相載體上的抗原。洗滌過程就可以洗掉被競爭下的酶標抗體，最后加底物顯色。最終顯色的結果與待檢原（或抗體）量成反比。直接競爭抑制ELISA的原理如圖5。注意在直接競爭抑制ELISA中，同一預制備的體系既可以測定抗原，也可以測定抗體。
圖5直接競爭抑制ELISA原理
如同間接ELISA一樣，直接競爭抑制ELISA也有兩步信號放大的過程，因此其靈敏度也比較高，但是預先包被好固相載體并加入酶標抗體后，實驗時只需要將待檢抗原或抗體稀釋后加到體系中進行反應即可，大大簡化ELISA的操作過程。用到此系統的試劑盒如德國(LDN) cortisol，DHEA-S,Estradiol等這些指標。
間接競爭抑制ELISA可以看作是用待檢抗原或待檢抗體干擾一個預先制備的間接ELISA系統。其具體原理是：將抗原包被于固相載體上，依次加入特異性的抗體以及此抗體對應的酶標二抗作為預制備的體系。實驗時，加入稀釋好的待檢抗原（或抗體），待檢標本中的抗原（或抗體）就和預制備體系中固相載體上結合的抗原（或抗體）競爭結合特異性的抗體（或固相載體上結合的抗原）。同間接ELISA一樣，間接競爭抑制ELISA也有三步信號放大以其靈敏度也比直接競爭抑制ELISA高。試劑盒（PHOENIX）ACTH,CRF指標中會用到此系統。
從上述原理可以看出，競爭抑制ELISA對試劑的要求非常少，不管是單抗還是多抗都可以用于實驗，更重要的是不管被檢對象是大分子物質還是多肽、小分子藥物、小分子激素等只有一個表位的分子不能使用夾心ELISA的都可以使用競爭抑制ELISA檢測。另外，像乙肝標志物檢測中，e抗原很不穩定，容易降解變為核心抗原，因此在檢測e抗體時不能用夾心ELISA檢測而只能選用競爭抑制ELISA。
除以上介紹的幾種基本的ELISA外，人們還可以根據自己的實際需要靈活設計其它類型的ELISA，例如引入非酶標二抗或者ProteinA、ProteinG等增加固相載體的載量或者增加系統的特異性等。
