熒光定量PCR(qPCR)是以熒光為基礎的定量分析技術，應用非常廣泛，可以用于定量RNA豐度(RT-qPCR)，驗證芯片或測序的數(shù)據(jù)，確定病原體的載量，進行基因分型等等。
熒光定量PCR儀負責監(jiān)控反應體系中熒光強度的變化，記錄檢測熒光達到閾值時的循環(huán)數(shù)(被稱為Ct或Cq值)。從理論上說，每一個qPCR循環(huán)會使目標序列翻倍，因此人們可以在Ct值的基礎上對樣本進行定量。
在進行熒光定量PCR時，我們往往會面臨眾多選擇，每一步選擇都影響著實驗的最終結果。好在市面上的qPCR產(chǎn)品也種類繁多，可以滿足我們的各種需求。
染料法VS探針法
熒光定量PCR主要分為染料法和探針法兩種。染料法一般采用DNA染料SYP® Green(或Promega的PYT® Green等)，這種方法不僅使用簡單，成本也最低。不過染料法檢測的是體系中的所有雙鏈DNA，不具有序列特異性。為此，一些廠商提供ROX作為內(nèi)部熒光參考標準，用來校正背景。
染料法
成本低是染料法qPCR的一個主要優(yōu)勢，DNA染料相對比較便宜，而且適用于任何序列。不過染料法無法在同一個樣本中檢測多個指標，也難以鑒定擴增得到的序列，會受到脫靶效應(如引物二聚體)的影響。在這種情況下，就需要進行熔解曲線分析，判斷擴增所得產(chǎn)物是否只有一種。
據(jù)安捷倫的Surekha Karudapuram介紹，熔解曲線分析能夠幫助研究者確定擴增的特異性。她還指出，理論上利用熔解曲線也可以進行多染料的反應，甚至可以粗略定量那些峰值。
市面上可供選擇的染料法master mix非常多，例如：安捷倫的Pilliant III Ultra-Fast SYP® Green QPCR & QRT-PCR master mixes，Bio-Rad的SsoAdvanced™ SYP® Green Supermix，Life Technologies的SYP® Select Master Mix，Promega的GoTaq® qPCR Master Mix，Qiagen的Type-it CNV SYP Green PCR Kits，羅氏的FastStart SYP Green Master，Sigma-Aldrich的KiCqStart® SYP® Green qPCR ReadyMix™，以及Thermo的Luminaris Color HiGreen High ROX qPCR Master Mix等等。
TaqMan探針
探針法qPCR使用具有序列特異性的熒光寡核苷酸探針。目前最常用的是Life Technologies公司的TaqMan®探針，該探針5’端連有熒光基團，3’端連有淬滅基團。在反應進行時，探針與正反向引物之間的模板結合，當聚合酶到達探針處時，酶的5’-3’外切活性將熒光基團切下，使其脫離淬滅基團，發(fā)出熒光。
探針法與染料法的最大區(qū)別在于，理論上探針法中的熒光信號只來源于目標序列。此外，人們還可以利用不同探針，在一個體系中同時檢測多種指標。
市面上的探針法master mixes也是琳瑯滿目，包括：安捷倫的Pilliant III Ultra-Fast QPCR & QRT-PCR Master Mixes，Bio-Rad的SsoFast Probes Supermix，Life Technologies的TaqMan Fast Advanced Master Mix，Promega的GoTaq Probe qPCR Master Mix，Qiagen的Type-it CNV Probe PCR +qC Kit，羅氏的FastStart TaqMan Probe Master，以及Thermo的DyNAmo ColorFlash Probe qPCR Kit等等。
據(jù)估計，SYP Green或TaqMan的使用者占qPCR用戶總數(shù)的80-90%，其他用戶采用的也基本上是上述兩種方法的變種，例如分子信標和Scorpion®探針。
其他探針
分子信標是一個發(fā)夾結構的DNA探針，兩頭分別帶有熒光基團和淬滅基團。與TaqMan一樣，分子信標的序列也與擴增引物之間的模板互補。在退火階段，這種探針的發(fā)夾結構展開與模板結合，這時熒光基團與淬滅基團分開，發(fā)出與模板豐度相對應的熒光信號。Scorpion探針將分子信標與PCR引物結合起來，在擴增階段引物延伸形成PCR產(chǎn)物，產(chǎn)物中的序列能夠與探針互補結合，使探針發(fā)夾結構打開，發(fā)出熒光。
此外，Promega還開發(fā)了一種新型的Plexor® qPCR系統(tǒng)。在Plexor系統(tǒng)中，引物含有經(jīng)修飾的核苷酸(iso-dC)和熒光基團。隨著擴增的進行，DNA聚合酶會向DNA鏈中引入熒光淬滅基團，使體系中的熒光逐漸減弱。其他qPCR方法記錄熒光的增強，而Plexor記錄的是熒光的衰減，Promega的市場經(jīng)理Gapiela Saldanha解釋道。
據(jù)Saldanha介紹，Plexor將探針法的序列特異性，與染料法的熔解曲線分析結合起來。“你可以驗證目標擴增的特異性，”她說。此外，Plexor檢測不同靶序列只需要兩種引物，使多重分析的設計更為容易。
基因表達分析
從SNP分型、拷貝數(shù)分析到病原菌檢測，qPCR應用范圍非常廣，不過最常見的是用qPCR進行基因表達分析。基因表達分析往往需要定量樣本中的特定RNA，例如mRNA、microRNA、或長非編碼轉錄本。進行這樣的分析，首先要將RNA轉變?yōu)榭梢詳U增的DNA，進行cDNA合成。
RT-qPCR試劑盒主要分為一步法和兩步法。一步法試劑盒將cDNA合成與qPCR合并為一步，速度更快，也更適用于自動化流程。兩步法雖然需要進行兩次反應，但反應的效率更高，而且可以允許用戶保留cDNA樣本，能夠在一個RNA樣本中檢測多個轉錄本。
“兩步法(qPCR)更有優(yōu)勢，其cDNA合成和qPCR反應的效率更高，”Saldanha說。安捷倫，Bio-Rad，Life Technologies，Promega，羅氏和Qiagen都提供有相應的RT-qPCR試劑盒。
樣本的挑戰(zhàn)
熒光定量PCR結果的好壞往往取決于核酸制備的質(zhì)量。處理環(huán)境樣本(如土壤)和植物樣本比較困難，因為其中往往含有抑制PCR反應的物質(zhì)。此外，F(xiàn)FPE樣本也較難處理，其中不僅有PCR抑制劑，樣本中的核酸可能也遭到了降解。
“這種情況對于靈敏度要求較高，因為模板量非常少。”Karudapuram說，“需要提取更純的核酸，并且使用能擴增少量初始模板的master mix。”我們可以選用進行了相應優(yōu)化的核酸提取試劑盒，例如Promega的ReliaPrep™ FFPE RNA Miniprep System或者Life Technologies的Plant RNA Reagent等等。
選擇理想的qPCR擴增引物，也是一個不容忽視的問題。專家認為，對于相同基因的檢測，最好采用已經(jīng)標準化了的引物。目前，不少供應商都為研究者們準備了預先設計好的qPCR文庫，例如Sigma-Aldrich公司就制備了人類、小鼠、大鼠和斑馬魚的文庫。此外，Qiagen，Life Technologies，和Thermo等公司也提供有類似的工具。
qPCR儀與數(shù)字PCR
從本質(zhì)上來講，熒光定量PCR儀就是PCR儀與熒光檢測儀的結合，用于記錄qPCR反應時產(chǎn)生的數(shù)據(jù)。市面上的qPCR儀主要有以下幾種：安捷倫的Mx3000P qPCR System，Bio-Rad的CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System，Illumina的Eco Real-Time PCR System，Life Technologies的QuantStudio™ 12K Flex System，Qiagen的Rotor-Gene Q，羅氏的LightCycler® systems，以及Thermo的PikoReal Real-Time PCR System等。
熒光定量PCR已經(jīng)是一個相當成熟的技術了，不過當樣本間的絕對差異較小時，qPCR檢測的效果并不那么理想。例如，qPCR很難區(qū)分一個基因兩拷貝和三拷貝之間的差異。好在，能夠進行絕對定量的數(shù)字PCR技術誕生了。
數(shù)字PCR將樣本分為許多份，使每一份包含零或一個拷貝的模板。然后在每一份樣本中運行qPCR反應，對呈陽性的孔進行計數(shù)，以此確定樣本中模板分子的絕對數(shù)量。這一技術的精確性非常高，可以區(qū)分很小的拷貝數(shù)差異。Bio-Rad、Fluidigm、Life Technologies和RainDance是目前幾家主要的數(shù)字PCR廠商。
