隨著熒光檢測的普及，許多研究人員正考慮將western blot的檢測方法從化學發光轉到多重熒光。這一趨勢背后有多個推動力。最重要的是，熒光檢測能夠實現多重western blot分析，每次能夠同時檢測幾個目標蛋白，而不再需要剝離和重新雜交。熒光的其他好處在于動態范圍更寬、信號穩定性更好。
熒光blotting的小貼士
• 抗體濃度應當優化，在幾種不同稀釋度的抗體中孵育膜。選擇信噪比最高的稀釋度。
• 從化學發光轉到熒光檢測時，一抗濃度應當增加；通常來說是增加2-5倍。二抗濃度可能也需要優化；1:5,000稀釋是個不錯的起點。在使用特定抗體時，可以參照生產商的建議。
• 為了讓信噪比最高，應使用自發熒光低的膜，如 Immun-Blot® low fluorescence (LF) PVDF membrane。
• 許多封閉液都成功用于熒光檢測。我們建議使用0.5-5% 酪蛋白、最多5%的脫脂奶粉，或最多3% BSA，溶于TTBS中。
• 緩沖液中的顆粒可能停留在膜上，并造成熒光假象。只使用高質量的試劑，并對所有緩沖液過濾滅菌。
• 使用鈍的鑷子從邊緣操作。避免劃破膜或弄皺，這會在熒光檢測時造成假象。
• 使用鉛筆來標記膜，因為許多墨水都會發出熒光。
• 溴酚藍會發出熒光。確保染料與樣品已分開，切掉凝膠上包含染料的部分，或省掉樣品緩沖液中的溴酚藍。
• 無需在暗處開展免疫檢測；正常的室內燈光不會使熒光標記的抗體發生光漂白。不過，熒光標記抗體的儲液應保存在暗處。
• 在處理膜時，使用無粉末的手套，以避免膜上出現假象或指紋。
多重分析的小貼士
• 使用來自不同宿主的一抗（如小鼠和兔）。兩個親緣關系相近物種的抗體（如大鼠和小鼠）通常會造成交叉反應，即使抗體已經過交叉吸附。
• 使用經過交叉吸附的二抗，以避免交叉反應。
• 使用光譜上不同的熒光基團偶聯物，避免交叉通道熒光。
• 在同時檢測多個目標之前，單獨優化每個目標的檢測。由于一些一抗并非很特異，在膜上會產生多條帶，故多重實驗之前的單目標檢測將有助于確定每個抗體的條帶模式。
• 大部分膜在波長較短的激發光下會顯示出較高的背景。記住，在藍色通道檢測最強的目標，在綠色通道檢測中等目標，而保留紅色通道來檢測最弱的目標。
