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酵母質粒提取離心法操作步驟

   2025-06-12 Biomiga(中國)893
 
酵母質粒提取離心法操作步驟:
1.         接種5 mL含有酵母攜帶所需質粒的YDP培養液,將其振蕩培養在30℃16-24小時。
2.         取1-3ml酵母培養菌體(使用< 2×107細胞),室溫下5000× g離心5 min。
3.         棄培養液,收集菌體,加入480μL Buffer SE30μL Lyticase solution。以最快的速度渦旋懸浮1min。充分懸浮細胞顆粒有助于提高得率。將其置于30℃消化30min左右。
注:在使用前確保β-mercaptoethanol已添加到Buffer SE (10µL /毫升)中,這種混合液可以在室溫很好的放置時間為1周。
4.         將混合液顆粒在4,000 x g室溫離心5min,棄上清完全。
5.         加入250 µL Buffer YPI重新懸浮混合液顆粒。
6.         加入50 mg 玻璃珠,然后以最快速度渦旋5min,讓樣品在玻璃珠作用下沉降穩定下來。轉移上清至一個1.5ml離心管中。
7.         加入250 µL Buffer YPII,反復顛倒混勻離心管4-6次以獲得干凈的溶解產物。將其室溫放置5 min。
注:此步應避免高強度混合,因為這將使染色體DNA斷裂以及降低質粒純度。YPII在存儲時要蓋緊蓋子。
8.         加入350µL Buffer YP III,用手大幅度顛倒混勻樣品直到形成絮凝白色沉淀。室溫下13,000 × g離心10min。
9.         將干凈的上清液小心轉移至DNA Mini Column,取上清時盡量不要打擾顆粒與沉淀。室溫下10,000 × g離心30s。倒掉廢液,將吸附柱重新插入收集管中。
10.      向吸附柱中加入500 μL Buffer KB,12,000 rpm轉離心30秒,棄收集管與廢液。
11.      將吸附柱放入一個新的收集管中,加入650 μL Wash Bufffer(確保已加入乙醇),12,000離心30秒,倒掉廢液,將吸附柱重新插入收集管中。
注:Wash Buffer 用無水乙醇稀釋后使用。
12.      可選步驟:重復步驟11。
13.      13,000 rpm 開蓋離心2分鐘。
注:開蓋離心有助于去除殘留乙醇,乙醇的有效去除保證DNA的洗脫。
14.      將柱子放入一個新的1.5ml離心管中,向柱中加入50-100 µL Elution Buffer(10 mM Tris-HCL, pH 8.5),室溫放置1 min,13,000 x g離心1 min進行洗脫。

可選步驟:第一次洗脫通常能得到75-80% DNA,用50-100 µL預熱(65°C) Elution Buffer再次洗脫DNA,第2次洗脫可收獲另外20%的DNA

 

 
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